CD44 和CD166 在直腸癌肝轉移診斷中的價值研究

司志英 靳 英 李有才 (忻州職業技術學院 檢驗教研室，靜樂 034000)

直腸癌為消化系統常見的一種惡性腫瘤，年發病率系消化系統腫瘤首位［1］。早期明確診斷，給予及時的手術治療，往往預后較佳。由于直腸癌不具有早期的明顯癥狀，不僅無法明確診斷，隨著患者病變進展，還可能發生肝轉移，也是影響手術治療及預后的最主要因素［2］。研究顯示，40.0%以上直腸癌患者確診時，均發生遠處轉移，多數為肝轉移［3］。另據文獻報道，肝轉移為直腸癌原發灶切除、晚期直腸癌患者死亡的關鍵因素［4］。本文回顧分析自2008 年10 月至2013 年10 月以來，于忻州市人民醫院治療的76 例直腸癌患者臨床資料，旨在研究直腸癌肝轉移患者腫瘤組織CD44 與CD166 陽性表達的臨床意義。報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 自2008 年10 月至2013 年10 月以來，于忻州市人民醫院治療的76 例直腸癌患者，依據是否出現肝轉移將其分為研究組(肝轉移組，n=40)、對照組(無肝轉移組，n=36)，研究組:女22例，男18 例，年齡39～75 歲，平均(58.5±4.3)歲，病程6 個月～3 年，平均(2.3±0.6)年;對照組:男19 例，女17 例，年齡38～73 歲，平均(57.4±3.1)歲，病程10 個月～5 年，平均(2.2±0.4)年，兩組在性別、年齡、病程方面均不存在統計學差異(P ＞0.05)。

1.2 納入標準 血常規、肝腎功能未見異常者;入組前疾病情況經影像學證實者;病理證實系直腸腺癌者;年齡在30～70 歲之間者;對本文研究知情同意并簽字者。

1.3 排除標準 排除既往過敏史、精神病史者;排除內科疾病或者其他嚴重臨床并發癥者;排除惡性腫瘤既往病史者;排除本文研究禁忌癥者。

1.4 實驗儀器及試劑 Nikon 光學顯微鏡、顯微照相系統;D293 型隔水式恒溫培養箱;SIEMENS Leica全自動脫蠟機;SIEMENS 1220HI 型烤片機、1210HI型撈片機、2145RM 型切片機。CD166 單抗;D44 單抗;聚合物輔助劑;二抗CD44/CD166 試劑盒:免疫組化SP 染色試劑盒;標記抗山羊辣根酶IgG 多聚體;小牛血清;PBS 緩沖液;DAB 試劑盒(均由北京中山生物科技有限公司提供)。

1.5 實驗方法 SP 免疫組化法。厚4 μm 連續兩張切片，于載玻片平鋪，65℃環境下過夜。分別予以CD44、CD166 免疫組化。按照常規進行二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，以蒸餾水沖洗，以PBS 進行5 min 浸泡。以枸櫞酸緩沖液于高壓下實施抗原修復，3 min 高壓鍋噴氣，室溫下冷卻。以3.0% 的H2O2于室溫下進行5～10 min 孵育，以PBS 液進行3 min 振蕩清洗，3 次重復后，滴加比例為1∶150 的CD44/CD166 羊抗人抗體，于37℃環境下進行1～2 h 孵育。以PBS 沖洗2 min，重復3 次后滴加聚合物輔助劑，于37℃環境下孵育20 min，以PBS 沖洗2 min，重復3 次后滴加標記抗山羊辣根酶IgG 多聚體，于37℃環境下進行20 min 孵育，以PBS 進行2 min 沖洗，3 次重復后以DAB 進行顯色，于顯微鏡下控制染色程度，以自來水沖洗10 min，以蘇木素進行復染2 min，予以鹽酸酒精進行分化，以自來水沖洗10 min 返藍。以梯度酒精常規脫水，以二甲苯透明，以中性樹膠進行封片。

1.6 觀察指標 觀察研究組CD44、CD166 陽性表達與年齡、性別、臨床分期、浸潤深度、淋巴結轉移、Dukes 分期、組織分化等病理參數的相關性，觀察對比兩組腫瘤組織CD44、CD166 陽性表達情況，觀察對比兩組CD44、CD166 陽性表達對生存率的影響。

1.7 實驗結果判定 以細胞質、上皮細胞膜呈棕黃色判定為CD44 陽性，切片無陽性細胞判定為CD44陰性。以細胞質、上皮細胞膜呈棕黃色判定為CD166 陽性，切片無陽性細胞判定為CD166 陰性。

1.8 統計學處理 選擇SPSS19.0 軟件對數據予以統計處理，其中計數資料對比選擇χ2檢驗，計量資料以±s 表示，將P ＜0.05 作為統計學差異。

2 結果

2.1 兩組腫瘤組織CD44、CD166 陽性表達情況對比 研究組CD44、CD166 陽性表達率分別為72.50%、85.00%，對照組CD44、CD166 陽性表達率分別為36.11%、41.67%，兩組相較，呈明顯差異(P ＜0.05)。具體如表1。

2.2 影響肝轉移直腸癌腫瘤組織CD44 表達因素分析 直腸癌肝轉移組腫瘤組織中CD44 表達，與年齡、性別、組織分化程度，無密切關系(P ＞0.05)，與浸潤深度、Dukes 分期密切相關(P ＜0.05)。見表2。

2.3 影響肝轉移直腸癌腫瘤組織CD66 表達因素分析 直腸癌肝轉移組腫瘤組織中CD166 表達，與年齡、性別、組織分化程度，無密切關系(P ＞0.05)，與浸潤深度、Dukes 分期密切相關(P ＜0.05)。見表3及圖1～4。

2.4 CD44、CD166 表達對兩組直腸癌患者生存率的影響對比 研究組CD44、CD166 陽性表達在1年、2 年、3 年、4 年、5 年各時間點的生存率情況，與對照組相較，均呈明顯差異(P ＜0.05)。如表4。

表1 兩組腫瘤組織CD44、CD166 陽性表達情況對比〔n(%)〕Tab.1 In tumor tissue of positive expression of CD44，CD166 two groups of contrast〔n(%)〕

表2 研究組CD44 陽性表達情況的影響因素分析〔n(%)〕Tab.2 Positive expression of CD44 factors〔n(%)〕

表3 研究組CD166 陽性表達情況的影響因素分析〔n(%)〕Tab.3 Positive expression of CD166 factors〔n(%)〕

表4 兩組CD44、CD166 陽性表達對生存率的影響對比〔n(%)〕Tab.4 Two positive impact on survival comparison〔n(%)〕

圖1 未轉移直腸癌組織中CD44 以弱陽性表達為主Fig.1 CD44 was weakly expressed in colorectal cancer tissues

圖2 肝臟轉移直腸癌組織中CD44 表達呈強陽性Fig.2 CD44 expression was strongly positive in liver metastasis of rectal cancer

圖3 未轉移直腸癌組織中CD166 呈弱陽性表達Fig.3 CD166 was weakly expressed in tissues of colorectal cancer

圖4 肝臟轉移直腸癌組織CD166 呈強陽性表達Fig.4 CD166 was strongly expressed in liver metastasis of rectal cancer

3 討論

CRC(大腸癌)為消化道最常見的一種惡性腫瘤。據文獻報道，該病患病率可達到0.05%，并且呈逐年上升態勢。目前，肝臟轉移為直腸癌患者出現遠處轉移比較常見的部位，因早期無顯著表現，診斷具有一定難度［5］。

文獻報道，腫瘤由異質性細胞構成，腫瘤細胞克隆分化與干細胞十分相似。研究顯示，因腫瘤干細胞為腫瘤起始細胞，能夠維持腫瘤的分化，具有浸潤、增殖以及異質特性。因此，腫瘤干細胞被認為是腫瘤的發生發展、復發轉移的根源，對其高度表達的標記物進行研究，具有非常重要的臨床價值［6］。

CD44 為細胞表面糖基化黏附分子，分布于內皮細胞、上皮細胞、纖維母細胞、單核細胞、粒細胞、T 細胞中，CD44 基因是高度保守的19～20 個外顯子構成，在11 號染色體的短臂上，經轉錄后，不同修飾方式可生成兩種蛋白，CD44s(標準型)、CD44v(變異型)。研究顯示CD44 高表達，不僅體現腫瘤進展，同時可對腫瘤侵襲、轉移起到促進作用［7］。

結直腸癌肝轉移的生物學變化十分復雜，腫瘤細胞表面受體可識別和黏附基底膜，腫瘤細胞自身可分泌多種蛋白酶，這些蛋白酶可降解基底膜和細胞外基質，基底膜被降解后，可伸出偽足，向周圍組織間質遷移。經脈管進入血液、淋巴循環并逃避免疫系統的攻擊，最后伴隨血液循環或淋巴循環到達繼發部位，于繼發部位組織發生黏附，形成克隆并增生生長，繼而促使微血管生成;最后形成轉移瘤。在本文結果中顯示，直腸癌肝轉移CD44 陽性表達，與未發生肝轉移組呈顯著差異，說明CD44 能夠作為直腸癌肝轉移的特征性標志物。對早期診療具有非常重要的臨床意義。此外，本文結果顯示，直腸癌Dukes 分期、浸潤深度與CD44 具有密切關系，Dukes分期與CD44 高表達呈增高態勢，說明CD44 能夠促進直腸癌腫瘤細胞進一步侵襲轉移，對治療方案的制定，也具有非常重要的臨床意義。CD166 為免疫球蛋白超基因家族中的成員，不僅能夠與機體淋巴細胞的抗原CD6 特異性結合，表現為同嗜性黏附、同型間結合，而且可以呈異嗜性黏附、異型間結合。CD166 在腫瘤組中呈高表達狀態，而且能夠調節腫瘤的生長、轉移［8］。本文結果顯示，直腸癌肝轉移CD166 陽性表達，與未發生肝轉移組有顯著差異，說明CD166 也能夠作為直腸癌肝轉移的特征性標志物。對早期診療也具有非常重要的臨床意義。同時，本文結果顯示，直腸癌Dukes 分期、浸潤深度與CD166 均具有密切關系，而Dukes 分期與CD166 高表達呈增高態勢，說明CD166 同樣能夠促進直腸癌腫瘤細胞進一步侵襲轉移。

文獻報道，CD166 低表達的腫瘤，其腫瘤細胞與原發灶的黏附性降低，便于其發生轉移，進而促進腫瘤細胞向遠處轉移［9］。但是也有臨床病例研究報道［10］，CD166 的高表達與大多數腫瘤的侵襲性、轉移及預后相關，我們的實驗結果與之相吻合。此外，也有一些有文獻報道，在直腸癌病例中，腫瘤組織中MVD(微血管密度)明顯升高，而且與CD166 的高表達呈正相關，此外與正常血管內皮細胞相比，由血管生成而來的血管內皮細胞的CD166 陽性表達更高。說明CD166 可通過促進新生血管的生成，促進腫瘤的進一步轉移。

綜上所述，直腸癌患者腫瘤組織CD44、CD166陽性表達，是肝轉移的特征性標志物，能夠判定直腸癌發生、發展過程，有助于直腸癌早期診療方案的制定。

［1］張 蓓，劉志蘇，黃漢濤，等.碳酸酐酶Ⅸ在直腸癌中的表達及其與血管內皮生長因子和肝轉移關系［J］.中華實驗外科雜志，2010，27(12):1898-1900.

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［4］沈藝南，黃晟宇，胡賢榮，等.腹腔鏡肝切除術治療結腸癌肝轉移的系統評價［J］.臨床肝膽病雜志，2014，30(12):1287-1291.

［5］中華醫學會外科學分會胃腸外科學組，中華醫學會外科學分會結直腸肛門外科學組，中國抗癌協會大腸癌專業委員會等.結直腸癌肝轉移診斷和綜合治療指南(V 2013)［J］.中華胃腸外科雜志，2013，16(8):780-788.

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［7］Li-chao Sun，Shu-ting Li，Long Yu.Interaction between colon cancer cells and human liver sinusoidal endothelial cells promotes liver metastasis of tumor cells［J］.Cancer Biol Med，2013，8(3):138-143.

［8］Boris Guiu，Julie Vincent，Séverine Guiu，et al.Hepatic arterial infusion of gemcitabine-oxaliplatin in a large metastasis from colon cancer［J］.World J Gastroenterol，2011，16(9):1150-1154.

［9］Ding YL，Zhou Y，Xiang L，et al.Expression of glioma-associated oncogene homolog 1 is associated with invasion and postoperative liver metastasis in colon cancer［J］.Inter J Med Sci，2012，9(5):334-338.

［10］Sun，Lichao，Hu，Hai，Peng，Liang.P-Cadherin promotes liver metastasis and is associated with poor prognosis in colon cancer［J］.Am J Pathol，2012，179(1):380-390.