沙眼衣原體持續感染狀態下STAT3-TLR2 信號軸的變化初探①

陳純靜 陳 恩 林 琳 羅奇志 李 偉 余 平 (中南大學基礎醫學院免疫學系，長沙 410008)

沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis，Ct)是一類嚴格細胞內寄生的革蘭陰性原核細胞微生物，也是最常見的性傳播性疾病(Sex transmitted disease，STD)的病原體之一。Ct 在宿主的持續感染可引起尿道炎、盆腔炎、異位妊娠、輸卵管性不孕等多種疾病［1-3］。雖然Ct 的感染可用抗生素進行有效治療，但由于感染后癥狀不明顯而延誤診治，常導致持續性感染(Persistent infection)［2］。因此，研究Ct 持續性感染的分子機制和機體的防御反應將為防治Ct持續感染提供重要的實驗依據。

Ct 在感染的黏膜和上皮細胞內呈特殊的二相發育周期。有感染性、無分裂能力的原體(Elementary body，EB)通過內吞作用進入宿主細胞，形成包涵體，在包涵體內EB 增大為無感染性但具分裂能力的網狀體(Reticulate body，RB)，RB 以二分裂方式增殖并分化成新的EBs，然后EBs 從細胞釋放再次感染新的宿主細胞，整個發育周期約需48～72 h［4］。研究表明，在γ-干擾素(Interferon γ，IFN-γ)作用下，Ct 在宿主細胞內形成非典型感染狀態，盡管包涵體依然存在，但無感染能力。電鏡下表現為包涵體內出現大量形態異常增大、疏松的RB，未見或極少見成熟的 EB［5，6］。低 濃 度 的 IFN-γ(0.2 ng/ml)可引起Ct 的持續性感染，其機制主要是誘生了吲哚加雙氧酶(Indoleamine dioxygenase，IDO)，通過降低細胞內色氨酸含量而抑制Ct 的生長發育［5，7］。但在Ct 持續性感染狀態下，如何發生免疫反應引起炎性損傷尚未見相關報道。

在炎性細胞因子中，IL-6 是具有最廣泛生物學效應的細胞因子之一，有明顯的促炎并導致組織病理損傷的作用。在Ct 感染后，尤其是在持續感染狀態下，上皮細胞持續高表達IL-6［8］。IL-6 可通過活化細胞內的信號轉導與轉錄激活因子(Signal transducer and activator of transcription，STAT)而發揮生物學作用。分泌至細胞外的IL-6 與其細胞膜受體結合后活化STAT3，二聚化的STAT3 進入核內啟動相關基因的轉錄表達，參與細胞增殖反應、急性炎癥反應以及細胞凋亡等［9］。

我們前期研究發現，在Ct 持續感染狀態下，IL-6 的表達和分泌水平明顯增高，同時STAT3 的基因表達水平也明顯增高［10］。有理由推測，在Ct 持續感染期間，異常分泌的IL-6 進一步活化了STAT3，從而引起炎性反應和組織損傷，但STAT3 活化后的下游信號如何發揮作用尚不清楚。在人類支氣管上皮細胞中，dsRNA 可誘導細胞因子IL-6 的分泌，IL-6通過活化STAT3 上調TLR2 的表達參與炎癥反應［11］。Tye 等［12］研究發現，在胃上皮細胞中STAT3可以作用于TLR2 基因，直接上調上皮細胞TLR2 的表達，引起IL-6 和IL-1 分泌增加。提示在上皮細胞中存在著由IL-6 參與的STAT3-TLR2 信號軸的活化［13］。但是在Ct 持續感染的上皮細胞中，活化的STAT3 是否也參與了TLR2 信號通路的調控尚不清楚。

在本研究中，我們利用IFN-γ 構建Ct 的持續性感染細胞模型，通過qRT-PCR、ELISA 和WB 等技術初步證實:在Ct 持續感染細胞中存在著STAT3-TLR2 信號軸的異常變化，此結果為衣原體持續性感染致病機制的研究提供了實驗依據。

1 材料與方法

1.1 試劑 HeLa229 細胞株(人宮頸癌上皮細胞，ATCC#CCL-2.1)為本實驗室保存。Ct 菌株(L2 血清型)由美國德克薩斯州健康科學中心鐘光明教授惠贈。IFN-γ 購自Sigma;DMEM 培養基、小牛血清購自Hyclone;MMLV 逆轉錄試劑盒購自Fermantas;qRT-PCR 試劑購自BioRad;TLR2、STAT3、p-STAT3兔抗人多克隆IgG 抗體購自Abcam 公司;β-actin 兔多克隆抗體購自Bioworld 公司;HRP-羊抗兔二抗購自北京康為世紀;人IL-1α 的ELISA 試劑盒購自BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和沙眼衣原體急性感染模型及持續性感染模型的建立

1.2.1.1 HeLa229 細胞用含有10% 小牛血清的DMEM 在37℃、5%的CO2培養箱中培養。參照文獻［10］進行Ct 感染、增殖、滴定、分裝的Ct 保存在-80℃。

1.2.1.2 建立Ct 急性感染模型:計數2 ×105個生長良好的HeLa 細胞，接種于25 cm2細胞培養瓶中，待細胞生長至單層，按照前述方法感染Ct(MOI=5)，37℃、5%CO2培養。

1.2.1.3 建立Ct 持續性感染模型:計數2 ×105個生長良好的HeLa 細胞，接種于25 cm2細胞培養瓶中，待細胞生長至單層后，按照前述方法感染Ct(MOI=5)。參照文獻和我們的前期實驗結果，在2 h 后加入0.2 ng/ml 的IFN-γ，37℃、5%CO2培養。

1.2.1.4 本實驗分別采用SPG 和IFN-γ 設計相應的對照。

1.2.2 熒光定量PCR 技術檢測TLR2 轉錄水平 分別在Ct 急性感染及持續性感染HeLa 細胞6、24和48 h 后收集細胞樣本，同時收集相同時間點未感染細胞樣本作為對照，按使用說明書用TRIzol 法抽提總RNA。將RNA 樣本用MMLV 試劑盒逆轉錄合成cDNA，保存在-80℃。參考文獻并利用Primer2.0 及Primer-Blast 設計待測基因的引物用于qRT-PCR 檢測mRNA 表達量(表1)，采用△△Ct 法計算各目的基因mRNA 的表達變化。使用BioRad CFX manager 2.0 分析干預后差異基因的表達情況。

新型降血糖化合物G004的遺傳毒性與生殖毒性研究…………………………………………………… 蔡 鳴等（22）：3078

1.2.3 ELISA 檢測IL-1α 分泌水平 分別在Ct 急性感染及持續性感染HeLa 細胞6、24 和48 h 后收集培養上清，同時收集相同時間點未感染培養上清樣本作為對照，分裝后保存在-80℃。用雙抗夾心ELISA 方法檢測上清液中IL-1α 濃度。操作根據試劑盒說明書進行。

1.2.4 Western blot 檢測蛋白的表達 利用含有蛋白酶和磷酸酶混合抑制劑的RIPA 細胞裂解液，分別在Ct 急性感染及持續性感染HeLa 細胞6、24 和48 h 后，提取細胞總蛋白，采用BCA 試劑盒檢測蛋白濃度，隨后上樣進行Western blot 實驗，最后用48 h 后，提取細胞總蛋白，采用BCA 試劑盒檢測蛋白濃度，隨后上樣進行Western blot 實驗，最后用ECL發光試劑盒檢測蛋白條帶。每次實驗同時檢測相應的β-actin(分子量46 kD)蛋白作為內參對照。

表1 qRT-PCR 引物序列Tab.1 Sequence of qRT-PCR primers

1.3 統計學分析 所有資料均由三次獨立的重復實驗獲得，數據使用SPSS13.0 軟件分析，采用獨立樣本的t 檢驗，結果用±s 表示，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 采用低濃度IFN-γ 建立Ct 持續感染的HeLa細胞模型 本實驗室已在前期研究中利用低濃度的IFN-γ 成功構建了Ct 持續性感染HeLa 細胞模型［14］。在本研究中，用0.2 ng/ml IFN-γ 誘導Ct 持續性感染狀態。在Ct 感染48 h 后，電鏡下觀察發現，Ct 感染細胞內的包涵體內出現大量形態異常增大、疏松的RB，而未見成熟的EB(圖1B)。將Ct 直接感染HeLa 細胞，建立Ct 的急性感染HeLa 細胞，電鏡下觀察發現:HeLa 細胞中的包涵體內出現大量的體積小而致密的EB，同時含有少量的RB(圖1A)。表明Ct 持續性感染和急性感染細胞模型建立成功。

2.2 Ct 持續感染狀態下STAT3 的表達與活化增加

2.2.1 收集Ct 不同感染狀態的HeLa 細胞裂解液，采用Western blot 技術檢測STAT3 蛋白的表達情況。結果顯示，在Ct 急性感染狀態和持續性感染狀態下，與對照組相比，STAT3 表達明顯增加;在相同時間點，Ct 持續感染狀態下，細胞STAT3 蛋白較急性感染狀態細胞的表達增加更明顯。說明在Ct 的持續感染狀態下，STAT3 表達明顯增加(圖2)。

圖1 Ct 急性感染和持續性感染電鏡圖Fig.1 Electron microscope pictures of Ct acute infection and Ct persistent infection

圖2 Ct 不同感染狀態下STAT3 的蛋白表達Fig.2 Expression of STAT3 protein in HeLa cells in different patterns of infection

圖3 Ct 不同感染狀態下STAT3 的活化Fig.3 Activation of STAT3 protein in HeLa cells in different patterns of infection

圖4 Ct 不同感染狀態下，HeLa 細胞中TLR2 的mRNA 轉錄水平Fig.4 Transcriptional level of TLR2 mRNA in HeLa cells in different patterns of infection

圖5 Ct 不同感染狀態下，HeLa 細胞TLR2 的表達Fig.5 Expression of TLR2 in HeLa cells in different patterns of infection

圖6 Ct 不同感染狀態下，HeLa 細胞IL-1α 的分泌水平Fig.6 Secretion level of IL-1α in HeLa cells in different patterns of infection

2.3 Ct 持續感染狀態下TLR2 的表達升高 收集Ct 不同感染狀態下的HeLa 細胞總RNA，利用qRTPCR 方法分別檢測不同時間點(6、24、48 h)，不同感染模式下的TLR2 的mRNA 表達。結果發現，與急性感染狀態相比，Ct 持續性感染的HeLa 細胞在24 h 和48 h，TLR2 轉錄水平出現顯著性升高(圖4)。

2.4 Ct 持續感染狀態下TLR2 的表達增加 通過Western blot 技術檢測Ct 不同感染模式下細胞TLR2 的表達，結果發現:在Ct 感染HeLa 細胞的6 h，TLR2 的表達未有明顯的變化。在Ct 感染的24 h時，急性感染和持續性感染的細胞TLR2 表達均開始增加，持續性感染時表達更明顯。在IFN-γ 誘導的Ct 持續性感染48 h 后，HeLa 細胞的TLR2 表達出現了顯著的上調(圖5)，結果與其基因轉錄水平相一致。

2.5 Ct 持續感染狀態下IL-1α 的分泌升高 收集Ct 不同感染狀態的HeLa 細胞培養上清，采用ELISA 方法檢測細胞因子IL-1α 的分泌水平。結果表明:在Ct 急性感染和持續性感染狀態下，特別是持續性感染48 h，炎性因子IL-1α 的分泌顯著增加(圖6)。

3 討論

IFN-γ 是重要的內源性免疫和炎性介質，在巨噬細胞活化、炎癥、防御胞內菌、Th1 應答中發揮重要作用［15，16］。IFN-γ 與其受體結合后，通過細胞內信號轉導，啟動相關靶基因的轉錄和翻譯，參與多種生物學功能，如免疫調節、宿主防御、細胞周期、凋亡、炎癥等［16］。IFN-γ 既可防御細菌的急性感染，也能誘導細菌的持續性感染。IFN-γ 誘導的Ct 的持續感染與其濃度有關，高劑量的IFN-γ(2 ng/ml)可完全抑制Ct 的生長分化，而低劑量的IFN-γ(0.2 ng/ml)則引起Ct 的持續性感染［17］。我們利用0.2 ng/ml 的IFN-γ 建立了Ct 的持續感染HeLa 細胞模型。在Ct 持續感染48 h 后，電鏡下觀察發現Ct 持續性感染的HeLa 細胞中，其包涵體內出現大量形態異常增大、疏松的RB，而成熟的EB 較少見［14］。

我們的前期研究發現，在Ct 的持續性感染狀態下，HeLa 細胞分泌的IL-6 水平異常增高，這可能與IFN-γ 可以增強TLRs 誘導的IL-6 分泌有關，但具體的分子機制尚不完全清楚。分泌至細胞外的IL-6與其膜受體結合后通過細胞內信號轉導可以活化STAT3，STAT3 二聚化進入核內啟動相關基因的轉錄表達，參與細胞增殖反應、急性炎癥反應以及細胞凋亡等［18］。在人類支氣管上皮細胞和胃上皮細胞中，均存在著由IL-6 活化的STAT3-TLR2 正反饋信號軸［12，19］。提示在上皮細胞中存在著IL-6 參與的STAT3-TLR2 信號軸的活化，誘導炎性細胞因子的分泌增加［13］。在IFN-γ 誘導的Ct 持續性感染中，細胞STAT3 的表達和活化明顯升高，其變化趨勢與IL-6 的轉錄及蛋白質表達變化相一致。說明在Ct的持續性感染中，可能是IL-6 的異常分泌參與了STAT3 的活化。

此外，在Ct 持續性感染的48 h，TLR2 的基因和蛋白表達水平均顯著升高，與STAT3 的蛋白表達和活化增加趨勢一致，說明STAT3 的活化可能也參與了Ct 持續性感染狀態下上皮細胞TLR2 的表達上調，存在著STAT3-TLR2 信號軸的活化。在持續性感染的6 h 沒有明顯的TLR2 表達增加，持續感染24 h 時TLR2 的表達才開始增加。說明在Ct 持續性感染的早期TLR2 并沒有參與細胞炎性因子的分泌，可能是IFN-γ 或者其他的機制在感染的早期誘導了炎性細胞因子的分泌，TLR2 則主要在持續性感染的中晚期發揮作用。O'connel 發現在肺炎衣原體(Cp)感染后，細胞的活化需要MyD88 和TLR2 的參與，而且在感染的早期TLR2 即參與了促炎細胞因子和趨化因子的產生，進而招募巨噬細胞和淋巴細胞向感染部位聚集［20］。與我們的研究結果并不一致，可能是因為Ct 與Cp 的結構成分之間存在著差異和選用的感染靶細胞以及Ct 的感染狀態不同所致。

在Ct 感染的巨噬細胞中，有多種炎性細胞因子分泌，包括GM-CSF、TNF、IL-1α 和IL-6 等，IL-1α 和IL-6 通常被認為是TLR2 的主要效應分子［21］。我們的結果顯示，IL-1α 在Ct 持續感染的上皮細胞中分泌明顯增加，IL-1α 的分泌主要是在Ct 持續性感染的48 h 顯著增加，說明在Ct 持續性感染狀態下，TLR2 表達增加并誘導了其效應分子IL-1α 的分泌。

總之，在IFN-γ 誘導的Ct 持續性感染狀態下，IL-6 引起了STAT3 的活化增加，同時上皮細胞TLR2 的表達明顯增加，TLR2 效應分子IL-1α 也出現了過度分泌，存在著STAT3-TLR2 信號軸的活化。但STAT3 是否在誘導炎性細胞因子分泌中起著關鍵作用，而TLR2 又如何發揮作用，還需要我們進一步研究。

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