HBsAb 滴度高于10 000 mU/ml 外周血BCR CDR3 受體庫的組成及特征分析①

潘 娟 石 彬 馬 龍 姚新生 (遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗科，遵義 563003)

一直以來，乙型肝炎病毒(HBV)感染都是全球性的公共衛(wèi)生問題，全世界約有3.5 億人為慢性乙型病毒性肝炎(CHB)患者［1］。而根據(jù)我國衛(wèi)生部2008 年4 月統(tǒng)計結(jié)果，目前我國有0.93 億人受HBV 感染［2］。注射乙肝疫苗，誘導(dǎo)機(jī)體B 細(xì)胞產(chǎn)生乙肝抗體，無疑是防患于未然的重要措施。但多次調(diào)查和研究表明，通過接種現(xiàn)有乙肝疫苗只有約90%左右人群產(chǎn)生HBsAb，而有5%～15%的人群基本不產(chǎn)生HBsAb，其不應(yīng)答的機(jī)制目前尚未完全闡明［3，4］。有研究表明乙型肝炎人免疫球蛋白(HBIg)可有效阻斷母嬰傳播，也可保護(hù)各種易感人群［5，6］。但是，目前HBIg 是從健康獻(xiàn)血員中篩選而來，作為血液制品，原材料不足，成本昂貴，導(dǎo)致貨源緊缺。2013 年，我們通過統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，普通人群中約有千分之六左右的人外周血HBsAb 滴度高達(dá)10 000 mU/ml 以上，追蹤發(fā)現(xiàn)這類人群無任何病毒性肝病歷史和病毒性肝病傾向，這表明抗體保護(hù)效果好，且在研究期間維持在高水平，這說明抗體穩(wěn)定。那HBsAb 滴度高達(dá)10 000 mU/ml 以上的人群為何能產(chǎn)生這么高的HBsAb 滴度，又能穩(wěn)定維持在高水平且能起到很好的保護(hù)作用?本研究分析HBsAb 滴度高達(dá)10 000 mU/ml 以上樣本BCR CDR3受體庫的組成和特征，通過比對分析尋找可能的高親和力HBsAb 序列，為后續(xù)研究提供堅實的實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 從遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗科檢測乙肝五項的日常臨床標(biāo)本中，篩選出HBsAb 滴度高于10 000 mU/ml 而表面抗原陰性的樣本，并排除肝臟相關(guān)疾病及其他腫瘤等疾病。

1.2 主要儀器和試劑 ARCHTTECTI 2000sr 全自動免疫分析儀(雅培上海商貿(mào)有限責(zé)任公司);Illumina SEQ 高通量測序系統(tǒng)(美國Adaptive Biotechnologies 測序平臺);乙型肝炎病毒測定試劑盒(Abbott GmbH＆Co.KG 公司);淋巴細(xì)胞分離液(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限責(zé)任公司);DNA Marker(Tiangen 公司);DNA 提取試劑盒(Qiagen 公司)。

1.3 DNA 樣本制備及測序 采集符合要求的樣本外周血2 ml (EDTA-K2 抗凝)，F(xiàn)icoll 密度梯度離心法分離PBMC，商品試劑盒法提取淋巴細(xì)胞基因組DNA，外送美國 Adaptive Bio-technologies ImmunoSEQ 測序平臺進(jìn)行Illumina 高通量測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析 所獲得的測序數(shù)據(jù)及NCBI 數(shù)據(jù)庫中HBsAb 序列通過目前權(quán)威數(shù)據(jù)庫IMGT/High V-QUEST 在線軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 研究對象 B4、B5 為測序樣本，其性別、年齡和乙肝五項結(jié)果等臨床基本資料見表1。

2.2 數(shù)據(jù)的初步分析結(jié)果 測序結(jié)果經(jīng)IMGT/High V-QUEST 在線軟件初步分析，再經(jīng)過Excel 2010 進(jìn)一步篩選用作分析的總序列及獨特序列，結(jié)果見表2。

2.3 IGHV/D/J 基因家族的分布、IGHV-J 配對取用、CDR3 區(qū)長度分布及氨基酸取用情況 HBsAb滴度高于10 000 mU/ml 樣本B4、B5 BCR CDR3 區(qū)，均最高頻取用IGHV3、IGHV4，IGHJ4、IGHJ6 及IGHD3、IGHD6 基因亞群，見圖1。在IGHV-J 配對取用上，均最高頻取用配對IGHV3-J4、IGHV3-J6，見圖2。B4、B5 BCR CDR3 區(qū)長度以14 及15 個氨基酸長度為中線呈正態(tài)分布，最高頻取用的氨基酸依次為酪氨酸(Y)、甘氨酸(G)、天冬氨酸(D)、丙氨酸(A)、精氨酸(R)、絲氨酸(S)，兩端位點保守取用氨基酸，中間位點呈現(xiàn)氨基酸多樣性取用，見圖3。

表2 各樣本數(shù)據(jù)的初步統(tǒng)計分析結(jié)果Tab.2 Preliminary analysis data of each sample

圖1 IGHV/D/J 基因家族的分布Fig.1 Distribution of IGHV/ D/J gene subgroups

圖2 IGHV-J 配對取用Fig.2 IGHV-J matching

圖3 CDR3 區(qū)長度分布及氨基酸取用情況Fig.3 CDR3 length and amino acids frequency

表3 與NCBI 數(shù)據(jù)庫HBsAb H-CDR3 比對結(jié)果Tab.3 Comparison results between B4 B5 with NCBI HBsAb H-CDR3

2.4 與NCBI 數(shù)據(jù)庫中HBsAb 比對結(jié)果 從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得人源HBsAb 序列13 條，人工合成的HBsAb 序列105 條，B4、B5 BCR CDR3 受體庫與其比較，未發(fā)現(xiàn)完全相同的CDR3 序列。通過IMGT/High V-QUEST 分析，獲得7 條可比對分析序列，將B4、B5 BCR CDR3 序列與之比對，得到V 基因、J 基因、CDR3 長度完全一致的總序列數(shù)為1 160 條，獨特序列48 條，見表3。

3 討論

生物體在長期的種系進(jìn)化過程中形成一系列防御機(jī)制，包括固有免疫和適應(yīng)性免疫，同時形成了多種抗原識別機(jī)制，其中B 細(xì)胞特異性識別抗原和抗體形成及分泌作為適應(yīng)性免疫的核心問題，一直受到廣泛關(guān)注。B 細(xì)胞受體(B cell receptor，BCR)作為B 細(xì)胞識別抗原的重要分子也一直受到多方面研究，并在單克隆抗體制備、疫苗研發(fā)等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。近年來，隨著第二代高通量測序技術(shù)的發(fā)展，使得對個體BCR 受體庫全面分析成為可能，并在免疫組庫、全基因組庫、轉(zhuǎn)錄組庫等等方面得到廣泛應(yīng)用［7-9］，其中Illumina 的Solexa 測序技術(shù)因擁有三高一低(數(shù)據(jù)通量高、準(zhǔn)確度高、敏感性高但成本相對較低)的獨特優(yōu)勢使其廣泛應(yīng)用于各個研究領(lǐng)域［10-12］。

近幾年來，高通量測序技術(shù)也應(yīng)用到了單克隆抗體的篩選和制備［13-15］。Jin 等［16，17］用酶聯(lián)免疫斑點微陣列芯片分選乙肝疫苗志愿者外周血抗體分泌B 細(xì)胞，結(jié)合測序技術(shù)分析B 細(xì)胞抗體基因特征并成功制備了乙肝單克隆抗體，Zhang 等［18］人利用高通量測序技術(shù)，通過免疫BALB/c 小鼠也獲得乙肝單抗。這幾年，我們實驗室一直致力于研究TCR 及BCR CDR3 受體庫的組成和特征，前期課題組實驗利用第二代高通量測序技術(shù)初步分析了人HBV 疫苗接種前、后B 細(xì)胞H 鏈CDR3 受體庫的組成和特征。在臨床工作中，我們發(fā)現(xiàn)部分人群HBsAb 滴度水平超出儀器檢測上限，在2013 年，我們通過統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)普通人群中約有千分之六左右的人外周血HBsAb 滴度高達(dá)10 000 mU/ml 以上。以往多數(shù)研究的是乙肝疫苗志愿者，其抗體水平處于一般水平位，而HBsAb 滴度高達(dá)10 000 mU/ml 以上人群為何能產(chǎn)生這么高的HBsAb 滴度?又能穩(wěn)定維持在高水平?且能起到很好的保護(hù)作用?這類人群是否具有高產(chǎn)高親和力的抗體基因?本實驗利用Illumina Solexa 高通量測序技術(shù)及權(quán)威數(shù)據(jù)庫IMGT 中的High V-QUEST 在線軟件，分析HBsAb 滴度大于10 000 mU/ml 樣本BCR CDR3 受體庫的組成及特征，發(fā)現(xiàn)其在IGHV/D/J 三區(qū)及IGHV-J 配對取用上有著基本一致的特征。通過與NCBI 數(shù)據(jù)庫中人源HBsAb 序列及人工合成HBsAb 序列比對分析，獲得7 條可比對分析序列，以及V 基因、J 基因、CDR3 長度完全一致的總序列數(shù)1 160 條［13］，獨特序列48條，已獲得的48 條獨特序列為后續(xù)研究提供了堅實的實驗數(shù)據(jù)。

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