高脂飲食對(duì)小鼠內(nèi)臟脂肪組織T 細(xì)胞亞群的影響①

鄒倩蕾 張國(guó)俊 鄭雅靜 張會(huì)杰 王瑞芳 王 俠 宋向鳳 王 輝

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453003)

隨著人們生活方式和生活習(xí)慣的改變，全世界范圍內(nèi)肥胖相關(guān)疾病的發(fā)病率逐年增高［1］。WHO已將肥胖定位為一種重要的疾病，它已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)重要的公共衛(wèi)生問題。肥胖伴隨的局部及全身慢性低度炎癥狀態(tài)已經(jīng)得到研究者的廣泛認(rèn)可［2，3］。但目前關(guān)于炎癥的發(fā)生機(jī)制還未完全闡明。研究顯示，肥胖的脂肪組織內(nèi)有多種免疫細(xì)胞的聚集［4］。T 淋巴細(xì)胞是適應(yīng)性免疫的主要細(xì)胞，根據(jù)功能和產(chǎn)生的細(xì)胞因子的不同，T 細(xì)胞可分為CD4+T 細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞，而CD4+T 細(xì)胞又分為Th1、Th2 和Th17 細(xì)胞［5，6］。本研究通過高脂飲食誘導(dǎo)C57BL/6 小鼠建立肥胖模型，探討脂肪組織內(nèi)Th1、Th2 和Th17 細(xì)胞的變化規(guī)律，為肥胖癥及其相關(guān)疾病的機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 C57BL/6 雄性小鼠購(gòu)于北京維通利華公司;動(dòng)物高脂飼料購(gòu)于美國(guó)Research Diets Inc，含60%脂肪熱能;小鼠TNF-α ELISA 試劑盒、Th1、Th2和Th17 細(xì)胞流式檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)BD 公司;膠原酶Ⅱ購(gòu)于Sigma 公司。

1.2 高脂飲食誘導(dǎo)小鼠肥胖模型的建立 5 周齡的雄性C57BL/6 小鼠常規(guī)飼養(yǎng)在清潔級(jí)動(dòng)物房，保持溫度在22℃～26℃，濕度40%～60%，隨意自由飲水和進(jìn)食。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后將小鼠隨機(jī)分為2組，高脂組(HFD，給予高脂飼料)和對(duì)照組(NFD，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料)，喂養(yǎng)16 周，每天觀察，每周稱重。

1.3 血脂及葡萄糖的測(cè)定 高脂飲食16 周后眼球采血分離血漿，用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)總膽固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)和血糖(GLU)的含量。

1.4 內(nèi)臟脂肪含量和免疫器官指數(shù)的測(cè)定 高脂飲食16 周后，頸椎脫臼法處死小鼠，打開腹腔，游離附睪墊脂肪組織和腎周脂肪組織，稱取重量，計(jì)算內(nèi)臟脂肪系數(shù):附睪墊脂肪濕重/體重，腎周脂肪濕量/體重;同時(shí)剪取脾臟和胸腺，稱重并計(jì)算指數(shù):脾臟重量/體重，胸腺重量/體重。

1.5 脂肪組織內(nèi)細(xì)胞的分離及流式測(cè)定 取小鼠附睪墊脂肪組織，剪碎后加入1 mg/ml 的Ⅱ型膠原酶，37℃消化2 h，1 000 r/min 離心10 min 后取沉淀中的細(xì)胞，用PBS 洗滌2 次后加入RPMI1640 完全培養(yǎng)液(10% 胎牛血清)，同時(shí)加入PMA(終濃度100 ng/ml)、Ionomycin(終濃度1 μg/ml)和TPI，37℃培養(yǎng)5 h，分別用CD4、CD8、CD3、Th1、Th2、Th17 抗體孵育后進(jìn)行流式檢測(cè)。

1.6 血清TNF-α 的測(cè)定 采用ELISA 試劑盒測(cè)定血清中TNF-α 的含量，操作按說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 高脂飲食對(duì)小鼠體重及體重增加的影響 高脂飲食16 周后小鼠的體重從(19.9±0.20)g 增加到(48.4±3.28)g，而對(duì)照組小鼠體重從(19.8±0.62)g增加到(32.0±1.42)g，高脂組小鼠體重平均增加了(28.2±2.50)g，對(duì)照組小鼠平均增加了(12.2±1.46)g，兩組之間對(duì)比有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。

2.2 高脂飲食對(duì)小鼠體內(nèi)脂肪含量的影響 與正常對(duì)照組相比，高脂飲食16 周的小鼠附睪脂肪重量是對(duì)照組的4.8 倍左右，腎周脂肪重量是對(duì)照組的6.7 倍左右，脂肪指數(shù)也顯著不同，脾臟指數(shù)有增大的趨勢(shì)，胸腺指數(shù)有縮小的趨勢(shì)，但兩組間未見顯著差別(圖1)。

2.3 高脂飲食對(duì)小鼠脂代謝的影響 由圖2 可知，高脂飲食16 周后小鼠血清中CHOL、TG、HDL 和LDL 含量較對(duì)照組均明顯增高，但TG 增加相對(duì)較少，HDL/LDL 比值無明顯變化。

2.4 高脂飲食對(duì)小鼠附睪墊脂肪組織內(nèi)T 淋巴細(xì)胞的影響 高脂飲食16 周后小鼠脂肪組織內(nèi)CD3+、CD4+和CD8+T 淋巴細(xì)胞數(shù)均較對(duì)照組有所增高，其中CD8+T 淋巴細(xì)胞增多最顯著，進(jìn)一步分析CD4+T 淋巴細(xì)胞的亞群組成比例發(fā)現(xiàn)，高脂飲食組小鼠脂肪組織內(nèi)Th1 和Th17 T 淋巴細(xì)胞與對(duì)照組相比顯著增多，而Th2 細(xì)胞未見顯著差別(圖3)。

圖1 高脂飲食對(duì)小鼠內(nèi)臟脂肪含量的影響Fig.1 Effect of high fat diet on mice visceral fat

圖2 高脂飲食對(duì)小鼠血脂水平的影響Fig.2 Effect of high fat diet on mice blood lipids

2.5 高脂飲食對(duì)小鼠血清中血糖和TNF-α 產(chǎn)生的影響 高脂飲食16周后小鼠外周血血糖水平達(dá)到(10.10± 0.58)mmol/L，顯著高于對(duì)照組的(6.4±0.44)mmol/L，同樣TNF-α 的水平也比對(duì)照組明顯增高，是對(duì)照組的4.7 倍［(23.24±7.38)pg/ml vs(109.36±16.41)pg/ml］，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 高脂飲食對(duì)小鼠附睪脂肪組織內(nèi)T 淋巴細(xì)胞的影響Fig.3 Effect of high fat diet on T lymphocyte in mice epididymal fat tissue

表1 T 細(xì)胞亞群及TNF-α 與體重、內(nèi)臟脂肪指數(shù)、葡萄糖和膽固醇的相關(guān)性分析Tab.1 Analysis on correlation between T cell subsets，TNF-α and body weight (BW)，cholesterol (GHOL)，Glucose(GLU)，epididymis fat index (EFI)and perirenal fat index (PFI)

2.6 各指標(biāo)間的相關(guān)性分析 綜合以上結(jié)果，我們對(duì)肥胖的指標(biāo)、血脂和T 細(xì)胞亞群變化做了相關(guān)性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠脂肪中CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、Th1、Th17、TNF-α 與體重、附睪脂肪指數(shù)、腎周脂肪指數(shù)、血中總膽固醇、葡萄糖均呈極顯著的正相關(guān)(表1)。

3 討論

目前肥胖已經(jīng)成為現(xiàn)代社會(huì)影響人類健康的重要因素之一，越來越多的研究證明許多疾病與肥胖密切相關(guān)，如Ⅱ型糖尿病、心臟病、脂肪肝、動(dòng)脈粥樣硬化、癌癥等，因此對(duì)肥胖的研究已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)［7，8］。高脂飲食誘導(dǎo)肥胖是常用的肥胖動(dòng)物模型，本研究中，我們首先用高脂飲食誘導(dǎo)C57BL/6雄性小鼠建立肥胖動(dòng)物模型，結(jié)果顯示高脂飲食16周后，小鼠的體重和血脂與對(duì)照組相比顯著升高，平均體重是對(duì)照組的1.5 倍，增加的體重是普通飲食組的2.3 倍。體重的增加主要出現(xiàn)在內(nèi)臟脂肪和皮下脂肪的增多，一般認(rèn)為，內(nèi)臟脂肪在疾病的發(fā)生中扮演了重要角色［9］。我們的結(jié)果顯示了高脂組的附睪脂肪墊重量、腎周脂肪重量以及與體重之比明顯高于正常對(duì)照組，說明高脂飲食可誘導(dǎo)小鼠內(nèi)臟脂肪的增加，引起腹型肥胖的發(fā)生。

肥胖伴隨的局部及全身慢性低度炎癥狀態(tài)是多種疾病發(fā)生的重要原因［10］。脂肪組織內(nèi)有多種免疫細(xì)胞的聚集，如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T 細(xì)胞、B細(xì)胞、NKT 細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等等［11，12］。隨著肥胖的發(fā)生，這些免疫細(xì)胞的種類和數(shù)量均發(fā)生了變化，如巨噬細(xì)胞由M2 型轉(zhuǎn)變成M1型［13］。T 淋巴細(xì)胞是適應(yīng)性免疫應(yīng)答的主要細(xì)胞，具有很大的異質(zhì)性。在2009 年有三個(gè)小組分別在遺傳性肥胖小鼠模型和高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠中證明了脂肪組織中浸潤(rùn)的T 細(xì)胞對(duì)胰島素抵抗起著關(guān)鍵的作用［14-16］。我們?cè)诟咧嬍痴T導(dǎo)的小鼠肥胖模型中沒有檢測(cè)到免疫器官胸腺和脾臟指數(shù)的改變，同時(shí)外周血中的T 淋巴細(xì)胞也未發(fā)生顯著的改變，但用流式檢測(cè)到了附睪墊脂肪組織內(nèi)T 淋巴細(xì)胞的異常情況，CD3+、CD4+和CD8+T 淋巴細(xì)胞數(shù)均較普通飲食組有所增高，其中CD8+T 淋巴細(xì)胞增多最顯著，這和之前的研究一致［17，18］。CD4+T 細(xì)胞根據(jù)功能和產(chǎn)生的細(xì)胞因子的不同又分為Th 細(xì)胞和Treg 細(xì)胞，Th 細(xì)胞又分為Th1 細(xì)胞、Th2 細(xì)胞和Th17 細(xì)胞，我們進(jìn)一步分析CD4+T 淋巴細(xì)胞的亞群組成比例變化，發(fā)現(xiàn)高脂飲食組脂肪組織內(nèi)出現(xiàn)Th1 和Th17 T 淋巴細(xì)胞極化現(xiàn)象。有研究提示，Th1 和Th17 細(xì)胞通過產(chǎn)生IL-1、IL-6 和TNFα 和RANTES 增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的前炎癥功能，促進(jìn)脂肪組織炎癥，而Th2 通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞使其分化為抗炎的M2 細(xì)胞而抑制炎癥的發(fā)生［19］。隨著肥胖的進(jìn)展，脂肪組織內(nèi)T 淋巴細(xì)胞的增多早于巨噬細(xì)胞［15］，這提示T 細(xì)胞亞群的改變或再分布可能影響巨噬細(xì)胞的功能，從而誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生。

總之，我們的研究證明了高脂飲食可以誘導(dǎo)小鼠腹型肥胖的發(fā)生，增加脂肪組織內(nèi)CD3+、CD4+和CD8+T 淋巴細(xì)胞數(shù)量，使CD4+T 細(xì)胞朝向Th1 和Th17 方向極化，這為肥胖誘導(dǎo)局部炎癥的發(fā)生提供了理論基礎(chǔ)。

［1］Frederick CB，Snellman K，Putnam RD.Increasing socioeconomic disparities in adolescent obesity［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2014，111(4):1338-1342.

［2］Fuentes EFF，Vilahur G，Badimon L，et al.Mechanisms of chronic state of inflammation as mediators that link obese adipose tissue and metabolic syndrome ［J］.Mediat Inflamm，2013，2013:136584.

［3］Ye J，Gao Z，Yin J，et al.Hypoxia is a potential risk factor for chronic inflammation and adiponectin reduction in adipose tissue of ob/ob and dietary obese mice［J］.Am J Physiol Endocrinol Metab，2007，293(4):E1118-E1128.

［4］Schipper HS，Prakken B，Kalkhoven E，et al.Adipose tissueresident immune cells:key players in immunometabolism［J］.Trends Endocrinol Metab，2012，23(8):407-415.

［5］Harrington LE，Mangan PR，Weaver CT.Expanding the effector CD4 T-cell repertoire:the Th17 lineage［J］.Curr Opin Immunol，2006，18(3):349-356.

［6］Tong ZH，Shi HZ.Subpopulations of helper T lymphocytes in tuberculous pleurisy［J］.Tuberculosis (Edinb)，2013，93(3):279-284.

［7］Hursting SD.Minireview:the year in obesity and cancer［J］.Mol Endocrinol，2012，26(12):1961-1966.

［8］Wang ZNT.Inflammation，a link between obesity and cardiovascular disease［J］.Mediat Inflamm，2010，2010:535918.

［9］Giralt M，Villarroya F.White，brown，beige/brite:different adipose cells for different functions?［J］.Endocrinology，2013，154(9):2992-3000.

［10］Emanuela FGM，Marco de R，Maria Paola L，et al.Inflammation as a link between obesity and metabolic syndrome［J］.J Nutr Metab，2012，2012:476380.

［11］Patel PS，Buras ED，Balasubramanyam A.The role of the immune system in obesity and insulin resistance［J］.J Obes，2013，2013:616193.

［12］Mathis D.Immunological goings-on in visceral adipose tissue［J］.Cell Metab，2013，17(6):851-859.

［13］Kaminski DA，Randall TD.Adaptive immunity and adipose tissue biology［J］.Trends Immunol，2010，31(10):384-390.

［14］Feuerer M，Herrero L，Cipolletta D，et al.Lean，but not obese，fat is enriched for a unique population of regulatory T cells that affect metabolic parameters［J］.Nat Med，2009，15(8):930-939.

［15］Nishimura S，Manabe I，Nagasaki M，et al.CD8+effector T cells contribute to macrophage recruitment and adipose tissue inflammation in obesity［J］.Nat Med，2009，15(8):914-920.

［16］Winer S，Chan Y，Paltser G，et al.Normalization of obesity-associated insulin resistance through immunotherapy［J］.Nat Med，2009，15(8):921-929.

［17］Jiang E，Perrard XD，Yang D，et al.Essential role of CD11a in CD8+T-cell accumulation and activation in adipose tissue［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2014，34(1):34-43.

［18］Yang H，Youm YH，Vandanmagsar B，et al.Obesity increases the production of proinflammatory mediators from adipose tissue T cells and compromises TCR repertoire diversity:implications for systemic inflammation and insulin resistance［J］.J Immunol，2010，185(3):1836-1845.

［19］Rocha VZ，F(xiàn)olco EJ，Sukhova G，et al.Interferon-gamma，a Th1 cytokine，regulates fat inflammation:a role for adaptive immunity in obesity［J］.Circ Res，2008，103(5):467-476.