胚胎干細胞源性樹突狀細胞對同源性神經(jīng)前體細胞腦內(nèi)移植耐受誘導

梅愛農(nóng) 張?zhí)K明 (福建醫(yī)科大學省立臨床醫(yī)學院干部特診一科，福建省臨床老年病研究所，福建省立醫(yī)院老年醫(yī)學研究室，福州350001)

據(jù)研究，不成熟樹突狀細胞(immature dendritic cell，imDC)和免疫抑制因子作用下的耐受性樹突狀細胞(Tolerogenic DC，TDC)能誘導抗原特異性耐受［1］，另外研究表明干細胞或其衍生細胞如神經(jīng)前體細胞(Neural progenitor cell，NPC)，在特定的移植背景下會誘發(fā)機體的免疫反應，提示這類細胞移植仍然需要考慮移植排斥反應［2］。為此，本研究試圖利用胚胎干細胞源性樹突狀細胞(esDCs)來誘導針對同源性干細胞來源物比如NPCs 的免疫耐受，因為研究表明esDCs 可能與傳統(tǒng)骨髓源性imDC 一樣具有致耐受性［3，4］。研究中將利用胚胎干細胞來源的兩種細胞NPCs 和esDCs 的聯(lián)合移植，來觀察esDCs 對局部免疫細胞浸潤、細胞因子的偏移、外周淋巴系統(tǒng)的增殖性以及對NPC 細胞腦內(nèi)存活的影響。

1 材料與方法

1.1 動物及材料 實驗動物:6～8 周齡健康Sprague-Dawley 大鼠，體重180～220 g，隨機分成2組，每組18 只，購自華中科技大學同濟醫(yī)學院動物試驗中心。主要儀器:倒置相差熒光顯微鏡(Olympus CK40)、CO2培養(yǎng)箱(Heraeus)、流式細胞計數(shù)儀(BD Pharmingen)、酶標測定儀、凝膠成像分析系統(tǒng)(BioRad)、PCR 儀(Biometra)、SW-CJ 標準型超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)、江灣Ⅰ型C 鼠腦立體定位儀等。主要材料及試劑:pCXhrGFP ES-D3 ESCs、ES-D3 ESCs、SNL 細胞系來自同濟醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科試驗室;DMEM、DMEM/F12 培養(yǎng)基、胎牛血清、100×N2-supplement、50×B27 supplement、rm-bFGF(Gibco、Bibco BRL);纖維連接蛋白(Fn)、煙酰胺、β-巰基乙醇(Sigma);100×ITS 培養(yǎng)液(Hyclone);人白血病抑制因子(LIF)、兔抗Cy3-Nestin (Chemicon);rmIL-2、rmIFN-γ、rmGM-CSF、rmIL-3(Peprotech);四甲基偶氮唑藍(MTT)(Amresco);絲裂霉素C(Kyowa Hakka Kogyo Co.Lid);鼠抗FITC-MHC-Ⅰ、FITC-MHC-Ⅱ、CD4、CD8;兔FITCCD11c、PE-CD80、PE-CD83、PE-CD86(BD Pharmingen);鼠抗ED1(CD68)(Serotec);羊抗小鼠IgM 二抗、DAB 染色試劑盒(北京中杉金橋有限公司);Trizol 試劑盒(Omega Bio-tek，Inc);cDNA 逆轉錄試劑盒、PCR 擴增試劑盒(Fermentas，USA)。

1.2 試驗方法

1.2.1 pCX-hrGFP ES-D3 向NPCs 誘導分化 pCX-hrGFP ES-D3 用LIF 條件培養(yǎng)基(1%L-谷氨酰胺，1%β-巰基乙醇，1%青-鏈霉素溶液，1%非必需氨基酸，DMEM 培養(yǎng)液，20 ng/ml LIF)懸浮，于0.1%明膠包被的無滋養(yǎng)層的塑料培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%CO2飽和濕度溫箱中培養(yǎng)。待細胞團長滿瓶底的80%后，倒掉培養(yǎng)基，Trypsin/EDTA 消化、離心細胞后將單細胞懸液加入ES 完全培養(yǎng)基(LIF 條件培養(yǎng)基去除LIF)重新懸浮，調(diào)整細胞密度至1×105ml-1，按照(2～2.5)×104/cm2接種到低黏性細菌培養(yǎng)皿，加入ES 完全培養(yǎng)基，置37℃、5%CO2飽和濕度溫箱中連續(xù)培養(yǎng)4 d，細胞由接種時的單細胞長成懸浮的圓形細胞團，即擬胚體(EBs)。收集第4天的EBs 轉移到新的25 cm 普通培養(yǎng)瓶，添加ES 完全培養(yǎng)基，置37℃、5%CO2飽和濕度溫箱中培養(yǎng)24 h，待EBs 完全貼壁后輕輕倒掉培養(yǎng)基。加入無血清ITSF 培養(yǎng)基(5 mg/L insulin，50 μg/L 轉鐵蛋白，30 mmol/L 硒酸鈉，5 mg/L 纖維連接蛋白)，連續(xù)培養(yǎng)6 d。Trypsin/EDTA 消化，離心后加入誘導培養(yǎng)基(1% N2-supplement，1% B27-supplement，TrisbFGF 50 μl/50 ml DMEM/F12 培養(yǎng)基)將細胞重新懸浮，按照(1.5～2)×104/cm2接種到新的培養(yǎng)瓶。添加誘導培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)6 d，隔天換液一次。Nestin 熒光染色免疫細胞化學鑒定。

1.2.2 esDCs 的體外誘導培養(yǎng)及基本生物學特征檢測 將在無滋養(yǎng)層培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的ESCs 消化成單細胞懸液，按照(2～2.5)×104/cm2接種到低黏性細菌培養(yǎng)皿，加入EB 全培養(yǎng)基(20%FBS DMEM+1%L-谷氨酰胺、β-巰基乙醇、非必需氨基酸、丙酮酸鈉、青-鏈霉素溶液)，置37℃，5%CO2飽和濕度溫箱中連續(xù)培養(yǎng)4 d，細胞由接種時的單細胞長成懸浮的圓形細胞團，即EBs。EBs 培養(yǎng)第14 天后轉入組織培養(yǎng)瓶，加入EB 全培養(yǎng)液置37℃、5%CO2飽和濕度溫箱中培養(yǎng)過夜。待EBs 完全黏附后，換入esDC誘導培養(yǎng)基(終濃度為25 ng/ml rmGM-CSF 與10 ng/ml rmIL-3 的EB 全培養(yǎng)基)置37℃、5%CO2飽和濕度溫箱中培養(yǎng)，隔日換液，連續(xù)培養(yǎng)10 d。加入0.05%胰蛋白酶-EDTA 消化細胞3～5 min，加入等量培養(yǎng)液中止消化，并用吸管反復吹打成單細胞懸液。離心后棄上清，加入esDC 誘導培養(yǎng)基重懸細胞密度至1×106ml-1，按照(3～5)×105cell 接種到新的培養(yǎng)瓶置37℃、5%CO2飽和濕度溫箱中培養(yǎng)。隔日換液，細胞長滿80%瓶底后傳代。流失細胞術檢測初始型細胞及脂多糖誘導下MHCⅠ、MHCⅡ、CD11c、CD80、CD86 表達。

1.2.3 NPCs 體內(nèi)移植實驗 健康Sprague-Dawley大鼠，體重180～220 g，隨機分成esDCs 預處理組及對照組2 組，每組18 只。采用改良的線拴法制作MCAo 模型:用6%水合氯醛麻醉大鼠，頸部正中切口結扎頸外動脈，再在頸總動脈下方穿過2 條結扎線，將近心的線扎緊后，在兩線之間的血管壁上剪一個小口，插入0.2 mm 鈍頭釣魚線緩慢推進，感輕微阻力時停止，即為缺血開始，扎緊結扎線并固定插線，缺血1 h 后再將插線拔除，讓缺血區(qū)得到再灌注，為再灌注開始。NPC 腦內(nèi)移植:MCAo 術后1周，esDCs 預處理組動物尾靜脈輸注5×105esDCs，對照組注射PBS。術后2 周，兩組大鼠用6%水合氯醛麻醉，按Pellegrino 鼠腦定向圖譜行側腦室注射定位(以前囟為零點，前囟前0.7 mm，旁開2.0 mm，深3.5 mm)5×104pCX-hrGFP NPCs。

1.2.4 ED1、CD4、CD8 免疫組織化學檢測(n=6)移植2 周后(缺血后4 周)動物6%的水合氯醛(5 ml/kg)腹腔注射麻醉，4%的多聚甲醛灌注。取腦后于4%的多聚甲醛后固定6 h。于移植針孔后1 mm 連續(xù)冰凍切片，厚度20 μm，隔3 取1，分別對應行鼠抗ED1、CD4、CD8 免疫組化檢測。切片于3%過氧化氫孵育5 min，正常羊血清室溫下孵育20 min，吸干，加一抗抗體(1 ∶200)4℃過夜，按試劑盒說明書加入二抗，DAB 染色后常規(guī)脫水、透明、封片、鏡檢并照相。對應每個分子檢測，每只大鼠取3張切片，40×物鏡下在紋狀區(qū)隨機選取4 個視野進行計數(shù)，統(tǒng)計3 張切片共12 個視野細胞總數(shù)(面積0.72 mm2)。

1.2.5 淋巴細胞再刺激(n=6) 移植2 周后(缺血后4 周)分離培養(yǎng)頸部淋巴細胞，調(diào)整密度5×105ml-1。NPCs 細胞計數(shù)按5×104NPCs(200 μl)/孔接種96 孔板，用含F(xiàn)GF 的誘導培養(yǎng)基在37℃、5%CO2培養(yǎng)5 d，在淋巴細胞加入之前2 h 加入絲裂霉素C(20 μg/ml)滅活。每只動物取4 份5×104(100 μl)淋巴細胞分別加入3 個滅活的NPC 孔樣和一個空白孔樣，同時加入重組rIL-2 刺激淋巴細胞增殖，另外預留一個滅活NPC 的孔樣，加入100 μl 含F(xiàn)GF的誘導培養(yǎng)基。每只動物都對應3 個“淋巴細胞+NPC”孔樣，計為“LN”;1 個“淋巴細胞”孔樣，記為“L”;1 個“NPC”孔樣，記為“N”。在37℃、5%CO2飽和濕度溫箱中孵育68 h。在培養(yǎng)結束前4～6 h培養(yǎng)板各孔加入1 mg/ml MTT 液在37℃、5%CO2飽和濕度溫箱中培養(yǎng)6 h 后，每孔加入2%SDS 過夜培養(yǎng)。用酶標測定儀測570 nm 下的吸光度(A570)，淋巴細胞增殖指數(shù)(PI)用以下公式進行校正:PI=(LNA570nm-NA570 nm)/LA570 nm。

1.2.6 NPC 存活率的測定(n=6，來源同淋巴細胞再刺激亞組) 移植2 周后(缺血后4 周)，每組取6 只斷頭取腦，Oct 包埋，放入-70℃冰箱保存。連續(xù)冠狀面冰凍切片，厚度20 μm，隔10 取1。收集穿刺點前后約±0.5 mm 的腦片，觀察區(qū)(Regions of interest，ROI)為同側的紋狀體，在熒光顯微鏡×40 物鏡下取10 個對等的視野進行GFP 陽性細胞計數(shù)。

1.2.7 IFN-γ、IL-10 mRNA的逆轉錄PCR(RTPCR)(n=6) ①引物設計與合成:(北京三博遠志生物技術公司合成)，內(nèi)參β-actin (GenBank NM-031144):正義:5'-CATCCAGGCTGTGTTGTCCC-3'，反義:5'-TTCTCTTTAATGTCACGCACG-3'(240 bp);IFN-γ:正 義5'-GCTGGTGAATCACTCTGATG-3'，反義5'-GCCAAGGCACACTGATTGAA-3' (360 bp);IL-10:正義5'-AAACTCATTCATGGCCTTGTA-3'，反義5'-TGCCTTCAGTCAAGTGAAGACT-3' (346 bp)。②總RNA 的提取:移植2 周后(缺血后4 周)，每組各取6 只大鼠快速斷頭處死，取缺血側皮層和紋狀體50～100 mg 樣本，加入1 ml RNA 裂解液之后按每1 ml RNA 勻漿加265 μl 氯仿的比例，向Ep 管里加入適量氯仿，離心后按每1 ml RNAsolv 加入670 μl 異丙醇的比例向轉移的水相中加入異丙醇以沉淀RNA。離心后用75% 乙醇沉淀RNA 沉淀之后將RNA 重新溶解于Rnase-free 水中(50 μl)測定RNA濃度和純度，選取純度達標的樣本放入-70℃保存。③逆轉錄反應:逆轉錄反應體系總體積為20 μl。將總RNA 反應混合物(總RNA 10 μl，0.5 μg/ml OdT 1 μl，去離子水1 μl)加入200 μl Ep 管內(nèi)，置于70℃5 min，立刻冰水浴2 min 然后短暫離心。按照下列順序將各試劑加入上述管中:5×反轉錄buffer 4 μl;RNA 酶抑制劑1 μl;10 mmol/L dNTP Mix 2 μl;MMLV 逆轉錄酶(200 U/μl)1 μl，將反應混合物置于42℃60 min，在70℃加熱10 min 終止上述反應，然后置于冰上。以上合成的第一鏈cDNA 可以直接地用于PCR 擴增。④PCR 擴增:將下列反應物［10×PCR 緩沖液2 μl;2 mmol/L dNTP mix 2 μl;引物Ⅰ(10 μm)2 μl;引物Ⅱ(10 μm)2 μl;Taq DNA 聚合酶0.1 μl;25 mmol/L MgCl21.2 μl;DNA 模板5 μl;消毒雙蒸水5.7 μl］加入一個PCR 管中，置于冰上，混勻，短暫離心。將樣本加入熱循環(huán)儀進行PCR 擴增:初始變性過程-95℃3 min;變性、退火、延伸30個循環(huán)，變性為94℃1 min，退火為55℃40 s，延伸為70℃1 min;終末延伸過程:70℃ 10 min。⑤PCR產(chǎn)物的檢測:PCR 產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，觀察照相，采用凝膠成像分析系統(tǒng)對條帶進行半定量分析，根據(jù)樣品條帶光密度值與β-actin 光密度值之比確定樣品mRNA 含量。

2 結果

2.1 細胞準備和鑒定 自pCX-hrGFP ES-D3 mESCs 誘導分化的NPCs 常規(guī)消化后在bFGF 條件下保持擴增能力，并傾向于集落生長。Nestin 熒光染色顯示雙標陽性率為94% 以上，表明經(jīng)pCXhrGFP 轉染的ES-D3 mESCs 能穩(wěn)定表達GFP 綠色熒光并在傳代和誘導分化中保持熒光的穩(wěn)定性。是可靠的細胞分子標記物，可用于移植中的細胞計數(shù)標記(圖1A～C)。

圖1 細胞準備和鑒定:分別自pCX-hrGFP ES-D3 誘導NPCs 和ES-D3 誘導esDCsFig.1 Cell preparation and identification:differentiation of NPCs from pCX-hrGFP ES-D3 and esDCs from ES-D3 respectively

圖2 兩組大鼠紋狀體CD4，CD8，ED1 陽性細胞浸潤Fig.2 Infiltration of CD4，CD8，ED1 positive cells in striatum in two groups

圖3 兩組大鼠缺血腦組織炎癥因子表達Fig.3 Expression of inflammatory cytokine in ischemia lesions in two groups

圖4 兩組大鼠缺血紋狀體移植細胞存活比較Fig.4 Survivals of grafted cells in ischemic striatum in two groups

圖5 兩組大鼠頸部淋巴細胞增殖指數(shù)比較Fig.5 Proliferation indexes (PI) of cervical T lymphocytes in two groups

ES-D3 mESCs 經(jīng)“擬胚體”在細胞因子GM-CSF及IL-3 的作用下誘生的esDCs 呈集落性生長，運用傳統(tǒng)的消化方法將這些細胞繼代培養(yǎng)，在GM-CSF及IL-3 存在的情況下能繼續(xù)擴增，而保持一致的細胞形態(tài)。流式細胞術顯示這些細胞CD11chiMHCⅠmoMHCⅡloCD80loCD83loCD86lo。在連續(xù)培養(yǎng)超過4 周的時間后，細胞表面的MHCⅡ分子及共刺激分子CD80 等的表達未見上調(diào)。但esDCs 細胞在脂多糖的作用下，逐漸向成熟DC 形態(tài)發(fā)展，在培養(yǎng)的第4 天，大量的釘狀突起從周圍生長出，呈現(xiàn)出老化成熟表型(CD11chiMHCⅠhiMHCⅡhiCD80mo)，表現(xiàn)出強烈的誘導淋巴細胞增殖能力(圖1D～F)。如上說明本法獲得的細胞為與mDC 類似的樹突狀細胞，但通常狀態(tài)下呈不成熟表型。

2.2 ED1、CD4、CD8 免疫組織化學檢測 在預處理組紋狀體，CD4+細胞浸潤顯著低于對照組(134.7±36.2 vs 198.8±59.6，P＜0.01)，但CD8+細胞(145.8±45.4 vs 134.3±39.0，P＞0.05)及ED1+細胞(298.8±75.9 vs 302.2±88.5，P＞0.05)，二組間沒有明顯差別，提示esDCs 預處理主要對CD4+細胞浸潤產(chǎn)生影響(圖2)。

2.3 IL-10 與IFN-γ mRNA RT-PCR 半定量RTPCR 檢測缺血腦組織IL-10 與IFN-γ mRNA，預處理組與對照組缺血皮質(zhì)IL-10(1.147±0.260 vs 1.264±0.119，P ＞0.05)、IFN-γ(1.697±0.273 vs 1.829±0.250，P＞0.05)表達無顯著差異(圖3);提示esDCs預處理不改變?nèi)毖X組織局部炎性細胞因子水平。

2.4 NPC 存活率測定 NPC 移植之后2 周，進行存活GFP 陽性細胞計數(shù)。參與計數(shù)的腦片在注射點前后約±0.5 mm 之內(nèi)。兩組共收集符合要求的腦片52 張，計數(shù)每張腦片中10 個40×視野中GFP陽性細胞，成團細胞以單個細胞表示。統(tǒng)計結果示預處理組M=58.0(Qd=36.5，0～121)，對照組M=35(Qd=36.5，0～124)，U=209.5，Z=-2.353，P=0.019，兩組之間有統(tǒng)計學差異(圖4)。

2.5 頸淋巴細胞增殖實驗 移植兩周后取頸淋巴細胞與NPC 共培養(yǎng)，預處理組與對照組PI 值無顯著差別(1.245±0.211 vs 1.331±0.235，P ＞0.05)(圖5)。提示esDCs 預處理對NPCs 再刺激下頸淋巴細胞反應無影響。

3 討論

目前認為，干細胞及其衍生物比如NPCs 腦內(nèi)移植會引起局部免疫反應，因此干細胞的移植有必要考慮克服移植排斥反應［2，5］。在臨床移植中，通常運用免疫抑制劑如環(huán)孢素A 來削弱免疫排斥反應，這種方法的主要缺點是藥物的毒副作用大，因此移植免疫耐受策略一直頗受研究者重視，其中，以樹突狀細胞(DC)為平臺的免疫耐受策略是研究的焦點。研究證實，經(jīng)典樹突狀細胞如骨髓DC 及類漿細胞DC，具有捕獲和交叉遞呈外源抗原的能力，能用于誘導抗原特異性耐受［1］。在這種基本范例下，不成熟DC(imDC)表面MHC 分子及共刺激分子的低表達能誘導T 細胞耐受，相反成熟DC(mDC)高表達這些免疫分子從而激發(fā)效應T 細胞。imDC 不管是供體的還是受者的，都可以增加致耐受性［6］。

esDC 是一種直接從胚胎干細胞誘導分化的樹突狀細胞，這種細胞在形態(tài)、表型、功能方面均與傳統(tǒng)髓源性imDC 相似，具備強大的抗原攝取提呈能力，但在缺乏足夠刺激因子的作用下總是處于穩(wěn)定的不成熟狀態(tài)(Immature status)，因而是很有前途的耐受性DC［3，4］。因此，本研究試圖建立一種全新的干細胞移植耐受誘導模式，即從同一ESCs 中分別誘導出治療性細胞如NPCs 和耐受性DC 如esDCs，然后將二者同時或先后注入受者體內(nèi)誘導完全意義上的耐受。這種模式的基本原理是利用imDC 的“致耐受性”以及與同源治療細胞的“表型同一性”，巧妙地將以前耐受誘導途徑中的“抗原同遞過程”消除。

本研究發(fā)現(xiàn)，esDC 預處理的大鼠，不能減少局部CD8+細胞和ED1+細胞的浸潤，但能減少局部CD4+細胞的浸潤，同時增加移植細胞的存活率，提示esDC 可能通過減少局部CD4+T 細胞反應誘導免疫耐受。據(jù)研究，NPCs 引起的腦內(nèi)免疫反應模式主要為CD4+T細胞反應，可能與其表面MHCⅡ類分子在局部炎癥環(huán)境下表達上調(diào)有關［5，7，8］，因此，esDC 對CD4+T 細胞的抑制作用有助于移植物存活。據(jù)研究調(diào)節(jié)性T 細胞(Treg)在髓源性imDC 耐受誘導中起主要作用［1］。imDC 可以通過細胞-細胞途徑啟動先天性CD4+CD25+Tregs，后者可以對活化的反應性T 細胞“再教育”，通過“連鎖抑制”和“感染性耐受”等機制誘導T 細胞耐受［9，10］。imDC也可作用于誘導型CD4+CD25-Tregs(Tr1)，通過釋放“耐受性”細胞因子如IL-10、TGF-β 等起免疫抑制作用［11，12］。據(jù)研究這兩種調(diào)節(jié)性T 細胞歸巢部位不太一致，細胞因子依賴性CD4+CD25-Tr1 細胞傾向遷徙入炎癥地點如梗塞或移植部位，而自然發(fā)生CD4+CD25+Tregs 主要在淋巴器官中發(fā)現(xiàn)［9］，在本研究中，移植局部腦組織IL-10 抑制性細胞因子或刺激性細胞因子IFN-γ 等較對照組沒有明顯改變，提示Tr1 在esDCs 耐受誘導中可能不起主導作用，esDCs 誘導耐受作用是否與CD4+CD25+Tregs 有關，甚至是否主要通過“中樞”機制，即在受者胸腺模擬自身APCs 的陰性選擇機制克隆性刪除抗原特異性的T 細胞而起作用，有待進一步研究。另外，本研究發(fā)現(xiàn)esDCs 預處理的大鼠局部淋巴細胞對NPCs 再刺激反應與對照組無差別，可能主要與NPCs 體外環(huán)境下MHCⅡ類分子表達微弱有關［7，8］;也可能與耐受性DCs 來源有關，比如研究表明供者來源的DC 需通過受者DC 的間接提呈才能發(fā)揮耐受誘導作用［13］。

因此，本研究初步探討了esDCs 對同源性移植物的耐受誘導機制，發(fā)現(xiàn)esDCs 可能通過減少局部CD4+T 細胞反應提高移植物的存活率，但具體機制需要進一步研究，比如需要相應的細胞跟蹤實驗明確esDC 在體內(nèi)的遷徙及存活狀態(tài)，同時需要對移植局部及引流淋巴結T 細胞進行更細致的表型分型及與esDCs 的相互作用做深入探討。

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