甲殼質抗特應性皮炎的實驗研究

李秀梅 王國英 張 文 高美華 張 蓓 沈若武 叢蓓蓓

(青島大學醫學院免疫教研室，青島 266071)

特應性皮炎(Atopic dermatitis，AD)是一種慢性、復發性、炎癥性皮膚病，具有家族遺傳傾向。AD患者血液中IgE 水平升高，嗜酸性粒細胞增多。臨床上表現為皮膚干燥、紅斑、丘疹、水皰、滲出，重者可累及全身，常并發感染［1］。

AD 發病率較高，兒童發病率為15%～30%，成人發病率為2%～10%。在過去的30 年里，AD的發病率增長了約3 倍，尤其是在工業化國家，AD的發病率增長更為明顯［2］。迄今，臨床上沒有有效根治AD 的方法，主要應用激素治療，但長期使用激素會引起較多的副作用。AD 的發病機制目前尚未完全明確，普遍觀點認為與Th1/Th2 失衡有關，在AD 的發病過程中，Th2 免疫反應占主導地位，Th1免疫反應下降［3］。眾所周知，Th1 和Th2 具有相互抑制作用，因此，如何提高患者Th1 免疫功能從而抑制其Th2 免疫功能，成為尋找預防及治療AD 新方法的突破點。

甲殼質(Chitin)，又稱聚乙酰氨基葡萄糖，是一種生物高分子聚合物，廣泛存在于無脊椎動物的外殼和菌類的細胞壁中，來源廣泛，產量僅次于纖維素，是自然界第二大有機物質。目前，在醫用材料上的應用研究非常多［4-7］，發現其具有良好的生物相容性、無生物毒性。近期有報道1～10 μmol/L 的甲殼質顆粒具有誘導機體Th1 型免疫反應、抑制Th2型反應的作用［8］，在過敏性哮喘及過敏性腸炎的動物模型中，甲殼質具有減輕過敏體征、改善局部病變的作用［9］。過敏性哮喘、過敏性腸炎及AD 同屬特應性疾病，甲殼質這種抗過敏作用是否對AD 同樣有效，目前國內外尚未見報道。本實驗利用小鼠AD 動物模型探討甲殼質對AD 的形成與發展的影響，為甲殼質用于治療特應性皮炎提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF 級6～8 周齡BALB/c 雌鼠，體重(20±2)g，共28 只，購自山東大學實驗動物中心。所有動物適應性飼養1 周后進入實驗。

1.1.2 試劑及儀器 卵清蛋白(Ovalbumin，A5503，V 級)購自美國Sigma 公司，甲殼質(Chitin)、刀豆蛋白A(ConA)、紅細胞裂解液(R1010)、ELISA 試劑盒購自上海索萊寶公司，氫氧化鋁［Al(OH)3］購自天津市瑞金特化學品有限公司，胎牛血清購自北京全式金生物技術有限公司(Lot#60416)，RPMI1640 購自上海拜力生物科技有限公司HyClone 公司(SH30809.01B)。Olympus BX50 PM-CBAD 顯微照相裝置，Hitachi 低溫離心機，雷杜PT-6100 酶標儀。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立 小鼠隨機分為3 組:對照組(8 只)、模型組(10 只)、甲殼質組(10 只)。三組動物在第0、5 天分別進行腹腔注射，模型組腹腔注射卵清蛋白(OVA)液0.2 ml［含20 μg OVA 和2 mg Al(OH)3］，甲殼質組注射OVA 與甲殼質的混合液0.2 ml(含20 μg OVA 和25 μg 甲殼質)，正常對照組注射等量生理鹽水。從第12 天開始，每天給小鼠進行灌胃直至實驗結束，正常對照組和模型組每日灌胃0.2 ml 生理鹽水，甲殼質組每日灌胃0.2 ml 甲殼質懸液(3 mg/d)。從第15 天開始，小鼠背部皮膚外用OVA 進行皮膚激發，方法參考文獻［10］，簡述如下:用電動剃須刀將小鼠背部皮膚剃光，將浸有100 μl 0.1%OVA 溶液的1 cm2大小的四層紗布敷在模型組及甲殼質組小鼠背部，外用膠帶貼緊，對照組小鼠用浸有生理鹽水的紗布外敷。1 周后將紗布取下，中間休息2 周，于第36 天重復皮膚激發1 周，第43 天處死動物(圖1)，心臟取血，分離血清用于抗體測定。背部激發部位皮膚取材，置于10%福爾馬林液中固定。取脾臟進行脾細胞培養。

1.2.2 甲殼質顆粒的制備 將購得的甲殼質粉末放入研缽中研磨，過1250 目不銹鋼網篩，得到≤10 μm 的甲殼質小顆粒。將得到的甲殼質小顆粒以10 mg/ml 懸于生理鹽水中，5 600 r/min 離心10 min，棄上清，得到1～10 μm 的甲殼質顆粒［11，12］。

1.2.3 皮膚組織的標本制備及病理學觀察 小鼠背部取材的皮膚組織用10%福爾馬林溶液固定，經酒精梯度脫水、石蠟包埋、連續切片，用蘇木精-伊紅(HE)染色及甲苯胺藍染色，在光學顯微鏡下觀察各組小鼠炎癥處皮膚的病理變化。比較各組小鼠皮膚表皮層與真皮層的厚度變化，在高倍鏡下計數浸潤的炎性細胞、嗜酸性粒細胞及肥大細胞的數量和形態變化。

1.2.4 脾細胞培養 無菌條件下取小鼠脾臟，分別將各組小鼠的脾臟混合［13］，置于200 目不銹鋼濾網，用注射器內芯輕輕碾碎研磨，RPMI1640 培養液沖洗濾過，收集脾細胞懸液［14］。1 000 r/min，離心5 min，棄上清。加RPMI1640 吹打，分散細胞。加入3 倍于RPMI1640 液體量的紅細胞裂解液，靜置5 min。1 000 r/min，離心5 min，棄上清。用滅菌的PBS 緩沖液沖洗細胞兩次，1 000 r/min，離心5 min，棄上清。再次加PBS 緩沖液，取10 μl 進行細胞計數。調整細胞濃度為5～10 ml，1 000 r/min，離心3 min，棄上清。最后加入含10%小牛血清的RPMI1640 培養液(血清5 ml，雙抗500 μl，加RPMI1640 定容至50 ml)，置于37℃恒溫培養箱進行培養。24 h 后加入藥物刺激，各組小鼠脾細胞分三個處理組，ConA 刺激組［5 μg/(ml·well)］，OVA刺激組［50 μg/(ml·well)］，chitin 刺激組［100 μg/(ml·well)］，每個處理組設置3 個平行孔進行培養。孵育72 h，1 000 r/min，5 min 離心，收集細胞上清液，置-20℃冰箱保存用于細胞因子檢測。

圖1 AD 動物模型的建立Fig.1 Establishment of AD murine model

1.2.5 酶聯免疫吸附實驗 采用ELISA 法檢測血清總IgE、總IgG2a、OVA-特異性IgE 水平及脾細胞培養上清液中IL-4、IL-12、IFN-γ 細胞因子的水平。操作步驟按試劑盒說明書進行，在450 nm 波長測定吸光度(OD)值，計算蛋白質濃度。

1.3 統計學方法 采用SPSS17.0 統計分析軟件進行數據處理。本實驗所有結果均以±s 表示，實驗組之間用t 檢驗進行統計學分析，P＜0.05 有統計學意義。

2 結果

2.1 甲殼質減輕AD 小鼠背部皮膚的炎癥病理變化 經過腹腔注射OVA 及背部皮膚外用OVA 激發實驗，模型組小鼠背部皮膚肉眼觀察可見明顯紅斑、肥厚及脫屑，正常對照組小鼠皮膚未見明顯異常，而甲殼質組小鼠背部皮膚增厚較輕。顯微鏡下觀察，對照組小鼠的皮膚結構規則，皮膚厚度正常，真皮層無明顯炎癥細胞浸潤。模型組小鼠表皮及真皮均明顯不規則增厚，真皮層纖維組織增多且有大量的炎癥細胞浸潤。甲殼質組表皮與真皮的增厚程度、炎癥細胞的浸潤程度均介于對照組與模型組之間(圖2)。與模型組比較，甲殼質組小鼠真皮中的炎細胞浸潤總數明顯減少(圖3A)，差異顯著(P＜0.05);嗜酸性粒細胞數量明顯減少(圖3B)。甲苯胺藍染色顯示，模型組小鼠皮膚全層內肥大細胞數量明顯增多，與對照組比較有顯著統計學差異(P＜0.001)，較多肥大細胞胞膜不完整，有脫顆粒現象。甲殼質組小鼠皮膚全層浸潤的肥大細胞數量比模型組減少，差異顯著(P＜0.01)(圖4)。

圖2 小鼠背部皮膚組織病理學變化(HE 染色，10×10)Fig.2 Pathological changes of mice back skin (HE staining，10×10)

圖3 小鼠背部皮膚炎細胞浸潤數量Fig.3 Skin infiltration of inflammatory cells

圖4 小鼠皮膚組織中肥大細胞的分布(甲苯胺藍染色，10×10)Fig.4 Distribution of mast cells in mice skin (O-toluidine blue staining，10×10)

圖5 小鼠血清中抗體水平Fig.5 Serum levels of antibodies in mice

圖6 OVA 刺激脾細胞后培養液中IL-4、IL-12 和IFN-γ 的水平Fig.6 Cytokine levels produced by cultured spleen cells challenged with OVA

圖7 甲殼素刺激脾細胞后培養液中IL-12 和IFN-γ 的水平Fig.7 Levels of IL-12 and IFN-γ produced by cultured normal mice splenocyte challenged with chitin

2.2 甲殼質降低了AD 小鼠血清中IgE 水平，提高了IgG2a 水平 為了觀察AD 小鼠Th1 型和Th2 型抗體水平的變化，動物模型建成后，取小鼠心臟血液檢測血清中IgE 和IgG2a 水平。反復腹腔注射及皮膚外用OVA 刺激后，模型組小鼠血清中總IgE 和OVA 特異性IgE 水平明顯升高，與對照組比較有顯著性統計學意義(P＜0.001)(圖5A、B)，甲殼質組小鼠血清中總IgE 和OVA 特異性IgE 水平與模型組相比均明顯下降，差異有統計學意義(P ＜0.05，P＜0.001)(圖5A、B)。另外，甲殼質組小鼠血清總IgG2a 水平明顯高于模型組，差異具有統計學意義(P＜0.001)(圖5C)。

2.3 甲殼質提高脾細胞IFN-γ 水平，降低IL-4 水平 為了檢測長期應用甲殼質灌胃能否誘導AD 小鼠產生Th1 型細胞因子，抑制Th2 型細胞因子的產生，在動物模型建成后，取各組小鼠的脾細胞進行體外培養，并在培養液中加OVA 進行刺激，收集培養液上清，用ELISA 法測定IL-4、IL-12 及IFN-γ 蛋白水平。與模型組相比，甲殼質組脾細胞產生的IL-4明顯降低(P＜0.05)，差異有統計學意義。相反，甲殼質組脾細胞產生的IL-12 及IFN-γ 均比模型組高，其中IFN-γ 水平的差異具有統計學意義(P ＜0.05)(圖6)。

在正常對照組小鼠的脾細胞培養體系中分別加入甲殼質和ConA 進行體外刺激，結果顯示甲殼質體外刺激組，與ConA 刺激組相比，IL-12 的水平有所增高，但無統計學意義，而IFN-γ 顯著增高(P ＜0.001)(圖7)。

3 討論

特應性皮炎(Atopic dermatitis，AD)因其逐漸上升的高發病率、臨床特效療法的缺乏及部分患者最終發展成過敏性哮喘、過敏性腸炎已引起全球臨床醫生及科研工作者的重視。AD 患者免疫系統Th1/Th2 失衡，以Th2 型免疫反應為主［3］。眾所周知，Th1 與Th2 型免疫反應相互抑制，因此，誘導AD 患者的Th1 型反應從而起到抑制AD 患者Th2 型免疫反應，達到預防及治療AD 的目的成為此研究領域的一個熱門方向，其中，尋找合適的Th1 誘導劑是該領域的關鍵。本研究利用OVA 誘導的小鼠AD模型，探討了甲殼質對AD 的調節作用，研究結果證實甲殼質能夠誘發AD 小鼠產生Th1 型細胞因子，抑制AD 的Th2 型免疫反應，減輕AD 皮膚炎癥，為開發甲殼質的臨床應用提供了科學依據。

本實驗在Spergel 試驗方法的基礎上［10］，改進了建立AD 動物模型的方法，先行小鼠腹腔注射OVA 致敏小鼠，后在小鼠背部外用OVA 激發小鼠的皮膚過敏反應。動物模型組在OVA 皮膚激發兩周后，出現皮膚增厚，真皮內大量炎細胞浸潤，包括較多的嗜酸性粒細胞及肥大細胞浸潤，血清IgE 顯著增高，其組織病理學及血清學改變均符合AD 動物模型的特點［1］。

在利用OVA 進行動物模型建立的同時，給予小鼠甲殼質腹腔注射及長達四周時間的甲殼質灌胃(甲殼質組)，發現甲殼質能夠減輕AD 小鼠背部皮膚的炎癥，改善皮膚的病理組織變化，特別是減少真皮內浸潤的嗜酸性粒細胞及肥大細胞的數量，降低血清中IgE 的水平，說明甲殼質具有調節改善AD的作用。

為了進一步探討甲殼質改善AD 的作用機制，本研究進行了小鼠脾細胞的體外培養，在培養系統中加入甲殼質，結果顯示甲殼質能夠刺激正常小鼠脾細胞產生IL-12 及INF-γ，這與Strong 等［9］報道的實驗結果相符，說明甲殼質在體外能夠誘導正常小鼠脾細胞產生Th1 細胞因子。若用OVA 刺激培養的脾細胞，發現甲殼質組小鼠的脾細胞產生的IL-12和IFN-γ 水平明顯高于模型組，說明甲殼質在體內能夠誘導AD 小鼠脾細胞產生Th1 型細胞因子，這種作用被甲殼質組小鼠產生較高水平的IgG2a 進一步證實。根據Th1 與Th2 型免疫反應相互抑制的原理，甲殼質誘導的Th1 型細胞因子能夠抑制OVA 誘導的Th2 型免疫反應，從而降低AD 小鼠的血清IgE水平，減輕局部皮膚的炎癥反應。

不同直徑大小的甲殼質顆粒在機體中的作用不同，有報道直徑＞100 μm 的甲殼質顆粒不起作用，直徑在40～70 μm 的甲殼質顆粒引起炎癥反應，而直徑在1～10 μm 的甲殼質顆粒能夠調節呼吸系統的炎癥反應［8，15］。本研究結果證實了1～10 μm 的甲殼質顆粒對過敏性炎癥反應有調節作用。甲殼質在AD 動物模型中的調節作用與以往報道的甲殼質在哮喘動物模型、腸炎動物模型中的作用相似［13，16］。

總之，本實驗結果提示甲殼質通過誘導小鼠產生Th1 型細胞因子抑制AD 的Th2 型免疫反應，從而起到緩解AD 皮膚炎癥的作用。本實驗結果為今后甲殼質應用于臨床預防治療過敏性疾病提供了科學依據。

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