益氣養(yǎng)陰方對大鼠肺纖維化的干預作用及對Smad2、Smad7 蛋白的影響①

馮 佳 向 陽 夏 燕 蔡 杰 陳安平 楊年安 龔書識 劉冬梅 袁 林

(湖北民族學院風濕性疾病發(fā)生與干預湖北省重點實驗室，恩施 445000)

肺纖維化(Pulmonary fibrosis，PF)是由多種原因引起的嚴重肺間質(zhì)慢性疾病。主要病理特點表現(xiàn)為早期的彌漫性肺泡炎、間質(zhì)性肺炎、中性粒細胞等炎性細胞浸潤，導致后期的大量成纖維細胞病理性增生和細胞外基質(zhì)過度沉積，可引起呼吸衰竭，死亡率高達50%～70%［1］。肺纖維化的治療以糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑為主，但其療效不顯著，而且長期大劑量服用副作用大。近年來中醫(yī)藥在防治肺纖維化方面做了大量研究，并取得一定的成果，顯示了良好的前景［2］。益氣養(yǎng)陰方是本院臨床上治療肺纖維化的經(jīng)驗方，臨床實踐證明其能夠較好地改善患者的癥狀，提高患者的生活質(zhì)量。本課題組前期已證實益氣養(yǎng)陰方能夠降低肺間質(zhì)纖維化大鼠肺組織中TGF-β1 的含量，達到延緩肺纖維化的作用［3］。本實驗通過觀察益氣養(yǎng)陰方對博來霉素所致大鼠肺纖維化的干預作用及對Smad2、Smad7 表達水平的影響，進一步探討其治療肺纖維化的作用機制，為益氣養(yǎng)陰方的臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1.1 動物 健康清潔級雄性SD 大鼠60 只，體重為(230±10)g，購自湖北省動物實驗中心，合格證號:SCXK(鄂)2008-0005。

1.1.2 主要試劑 益氣養(yǎng)陰方(板黨、北沙參、麥冬、五味子、黃芪、石斛、遠志、川牛膝、竹節(jié)參、金銀花等)由湖北民族學院附屬民大醫(yī)院藥劑科提供，制備成含生藥1 g/ml 的溶劑;博來霉素購自浙江海正藥業(yè)股份有限公司;醋酸潑尼松片由浙江仙琚制藥股份有限公司生產(chǎn);兔IgG-SABC 免疫組化染色試劑盒、大鼠Smad2 和Smad7 免疫組化一抗、DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及造模 健康雄性SD 大鼠隨機分為正常組、模型組、中藥組、激素組、中藥+激素組5 組，每組12 只。除正常組外，余組大鼠以10%水合氯醛按3.5 ml/kg 腹腔麻醉，取仰臥位固定，頸部常規(guī)消毒，切開頸部皮膚，逐層鈍性分離暴露氣管，用注射器于環(huán)狀軟骨間刺入氣管內(nèi)，緩慢注入博來霉素(5 mg/kg)，注射完畢后立即將大鼠直立并旋轉(zhuǎn)，使藥物在肺內(nèi)均勻分布。正常組大鼠按上述方法經(jīng)氣管注入等量生理鹽水。從造模后第2 天開始給藥，給藥劑量根據(jù)成人與動物體重劑量換算而成。中藥組給予益氣養(yǎng)陰方1 ml/100 g 灌胃;激素組給予35%醋酸潑尼松溶液按1 ml/100 g 體重灌胃;中藥+激素組給予中藥加激素混合溶液按1 ml/100 g灌胃;正常組和模型組予等量生理鹽水灌胃。均每日1 次，連續(xù)給藥28 d。于實驗第28 天處死所有大鼠。完整分離出肺組織，取左肺下葉于10%中性甲醛中固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片，行HE 染色及免疫組化檢測。

1.2.2 肺組織病理學檢查 顯微鏡下觀察HE 切片，參照Hubner 等［4］方法確定肺纖維化程度。0級:正常肺;1 級:單個肺泡呈輕微纖維樣變厚(肺泡壁厚度小于正常3 倍);2 級:明顯肺泡纖維化，伴有小纖維灶形成(肺泡壁厚度大于正常3 倍);3 級:連續(xù)的肺泡纖維化區(qū)域(肺泡壁厚度大于正常3 倍);4 級:單個的纖維灶(面積小于10%);5 級:纖維灶融合(面積大于10%，且小于50%);6 級:大量連續(xù)纖維灶(面積大于50%);7 級:肺結(jié)構(gòu)嚴重破壞，出現(xiàn)肺大皰;8 級:出現(xiàn)纖維性閉塞，肺組織全部纖維化。參照Szapiel 等［5］方法確定肺泡炎程度.0 級:無明顯肺泡炎改變;1 級:輕度肺泡炎，肺泡間隔有少量炎性細胞浸潤，病變范圍小于全肺20%;2 級:中度肺泡炎，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡間隔明顯增寬，病變范圍占全肺的20%～50%;3 級:重度肺泡炎，肺泡融合，大量炎性細胞浸潤，膠原纖維沉積，病變范圍大于全肺50%。將等級資料轉(zhuǎn)化為計量資料，1級計1 分，每組10 個樣本分別評分，求平均值。

1.2.3 肺組織中Smad2、Smad7 表達的檢測 石蠟組織切片常規(guī)脫蠟水化，3%雙氧水滅活內(nèi)源性酶，然后進行熱修復抗原，滴加5%BSA 封閉液封閉，棄血清，分別滴加按1 ∶100 稀釋的Smad2 及Smad7 一抗(兔IgG)4℃過夜，滴加生物素化羊抗兔二抗，再滴加SABC 試劑，DAB 顯色后，蘇木素復染，脫水、透明、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。陰性對照用PBS代替一抗。胞漿呈清晰棕黃色為陽性，每張切片隨機選取5 個視野，觀察陽性表達的定位并用Image-Pro Plus6.0 圖像分析系統(tǒng)測定目標區(qū)域的平均光密度值(OD 值)，作為Smad2、Smad7 蛋白的表達強度。

1.3 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)使用SPSS16.0 統(tǒng)計軟件處理，以±s 表示，采用單因素方差分析(ANOVA)進行組間兩兩比較，LSD 檢驗，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 益氣養(yǎng)陰方對肺纖維化大鼠肺組織病理形態(tài)的影響

2.1.1 外觀形態(tài)觀察 正常組大鼠肺外觀未見明顯異常，表面光滑、色澤粉嫩、質(zhì)地柔軟、富有彈性。模型組大鼠肺顏色暗淡，有散在出血點，表面凹凸不平，局部可見大小不等灰白色結(jié)節(jié)，部分區(qū)域呈蒼白色，質(zhì)地較硬，肺組織彈性差，切面呈彌漫性實變。激素組大鼠肺表面有小片狀凹凸不平，呈暗紅色，程度較模型組輕，表面光滑，彈性較好;中藥組大鼠肺外觀與正常組大鼠相近，部分呈暗紅色，質(zhì)地均勻，彈性良好，無實變表現(xiàn)。中藥+激素組大鼠肺硬度稍增加，未見明顯實變，表面欠光滑，局部有散在小結(jié)節(jié)，但總體好于激素組。

2.1.2 HE 染色組織病理學觀察 光鏡下正常組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁完整，肺泡間隔無水腫，無炎性細胞浸潤;模型組肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，大部分肺泡萎陷、破壞，肺泡間隔增寬并伴有炎性細胞浸潤，大量膠原纖維沉積，毛細血管腔明顯增厚，部分閉塞;激素組肺泡大小不等，少量肺泡萎陷，間隔有膠原沉積，程度較模型組輕;中藥組、中藥+激素組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)、肺泡間隔厚度及炎細胞浸潤較模型組明顯減輕，成纖維細胞及膠原沉積減少，其中以中藥組大鼠肺組織纖維化程度減輕更為明顯所示，見圖1。

2.1.3 各組大鼠肺泡炎及肺纖維化程度分級結(jié)果模型組大鼠肺泡炎和肺纖維化程度評分明顯高于正常組(P＜0.01)，說明肺組織損傷嚴重，肺纖維化造模成功;激素組肺組織病理評分較模型組有所減少(P＜0.05);中藥組、中藥+激素組大鼠肺泡炎及肺纖維化程度與模型組相比減輕(P ＜0.01 或P ＜0.05)，以中藥組肺損傷減輕更為明顯，見表1。

2.2 益氣養(yǎng)陰方對肺纖維化大鼠肺組織Smad2 和Smad7 蛋白表達的影響 正常組Smad2 蛋白未見明顯表達;模型組肺泡上皮細胞及成纖維細胞胞漿中Smad2 蛋白高表達，且表達量明顯高于正常組(P＜0.01);與模型組相比，激素組、中藥組、中藥+激素組Smad2 陽性表達均減少(P＜0.05 或P＜0.01)，以中藥組表達量最低(P＜0.01);中藥組分別與激素組、中藥+激素組相比，Smad2 蛋白表達均具有顯著差異(P＜0.01);中藥+激素組Smad2 蛋白表達較激素組有所減少，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。正常組Smad7 蛋白在肺泡上皮細胞、支氣管上皮細胞及間質(zhì)細胞胞漿中大量表達;模型組Smad7 蛋白較正常組明顯減少(P＜0.01);與模型組相比，激素組、中藥組、中藥+激素組Smad7 蛋白表達增強(P ＜0.05 或P＜0.01)，以中藥組表達量最高(P＜0.01);中藥組分別與激素組、中藥+激素組相比，Smad7 蛋白表達具有統(tǒng)計學差異(P＜0.01 或P＜0.05)，見表2 及圖2、3。

表1 各組大鼠肺泡炎及肺纖維化程度分級(±s)Tab.1 Extent of alveolitis and pulmonary fibrosis in rats of different groups(±s)

表1 各組大鼠肺泡炎及肺纖維化程度分級(±s)Tab.1 Extent of alveolitis and pulmonary fibrosis in rats of different groups(±s)

Note:Compared with model group，1)P＜0.05，2)P＜0.01.

表2 各組大鼠Smad2 和Smad7 蛋白表達平均光密度值(±s)Tab.2 Average optical density of Smad2 and Smad7 protein in rats of different groups(±s)

表2 各組大鼠Smad2 和Smad7 蛋白表達平均光密度值(±s)Tab.2 Average optical density of Smad2 and Smad7 protein in rats of different groups(±s)

Note:Compared with model group，1)P＜0.05，2)P＜0.01;compared with YQYY group，3)P＜0.05，4)P＜0.01;compared with hormone group，5)P＞0.05.

圖1 各組大鼠肺組織(HE 染色，×400)Fig.1 Lung tissue of rats in each group (HE staining，×400)

圖2 各組大鼠Smad2 蛋白表達(免疫組化染色，×200)Fig.2 Protein expression of Smad2 in each group (immunohistochemical staining，×200)

圖3 各組大鼠Smad7 免疫組化染色(免疫組化染色，×200)Fig.3 Protein expression of Smad7 in each group (immunohistochemical staining，×200)

3 討論

肺纖維化是一種慢性彌漫性肺間質(zhì)炎癥性疾病，以成纖維細胞增生和細胞外基質(zhì)沉積為其主要病理特征，導致肺組織結(jié)構(gòu)的異常重塑，最終呼吸衰竭而死亡［6］。

自Thrall 等［7］發(fā)現(xiàn)向大鼠氣管內(nèi)注入小劑量博來霉素可致大鼠肺間質(zhì)纖維化，并且其病理過程與人類肺纖維化相似，氣管內(nèi)灌注博來霉素已成為建立肺纖維化動物模型的經(jīng)典方法。本實驗在造模28 天后發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠肺組織表面凹凸不平，部分區(qū)域呈蒼白色，質(zhì)地較硬，并且光鏡下觀察肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，大部分肺泡萎陷、破壞，肺泡間隔增寬并伴有炎性細胞浸潤，大量膠原纖維沉積，而且模型組大鼠肺泡炎和肺纖維化程度評分明顯高于正常組，說明肺組織損傷嚴重，提示肺纖維化造模成功。肉眼觀察中藥組與正常組大鼠肺組織相近，鏡下可見肺組織結(jié)構(gòu)大體完整，肺泡炎及肺纖維化程度顯著低于模型組。激素組、中藥+激素組大鼠肺泡炎及肺纖維化程度與模型組相比有所減輕，但效果不及中藥組，表明經(jīng)益氣養(yǎng)陰方治療后的大鼠肺組織損傷有明顯改善，提示該方具有減輕或抑制大鼠肺纖維化的作用。

肺纖維化的發(fā)病機制至今仍不明確，涉及多信號通路調(diào)控及多因子相互作用。轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)是促進纖維化的主要細胞因子，被公認為與肺纖維化的發(fā)生和形成關系最為密切［8］。TGF-β1 促進肺成纖維細胞過度增殖、分化，繼而促進膠原蛋白等細胞外基質(zhì)在肺間質(zhì)和肺泡間過度積聚，導致肺纖維化的發(fā)生與發(fā)展［9］。課題組前期證實肺纖維化大鼠肺組織內(nèi)TGF-β1 含量顯著增多，益氣養(yǎng)陰方能夠降低TGF-β1，減少肺組織成纖維細胞生成，達到緩解肺纖維化的目的。TGF-β/Smad信號通路是參與肺纖維化上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化的重要轉(zhuǎn)導途徑。Smad 是細胞內(nèi)參與信號轉(zhuǎn)導的蛋白，是TGF-β的下游底物，在肺纖維化信號通路中發(fā)揮重要作用［10］。Smad 蛋白分為受體活化型或通路限制性Smad(RSmads)、共同通路型Smad(Co-Smad)和抑制性Smad(ISmads)3 個亞家族，包括9 種Smad 蛋白。Smad2 屬于RSmads，其磷酸化激活是Smad 信號通路激活的重要標志之一，磷酸化的Smad2 與Smad4 結(jié)合形成復合體，激活胞核內(nèi)的核轉(zhuǎn)錄因子，啟動一系列反應，促進纖維化的形成［11］。Smad7 屬于I-Smad，是TGF-β 信號轉(zhuǎn)導途徑的主要抑制性調(diào)控蛋白。研究發(fā)現(xiàn)阻斷Smad7 內(nèi)源性表達可抑制肺上皮細胞的發(fā)育，增加肺組織羥脯氨酸含量，促進肺組織纖維化程度，提示Smad7 蛋白表達情況與肺纖維化關系密切［12］。采取藥物干預Smad 信號轉(zhuǎn)導過程及其關鍵信號分子表達己成為近年來研究抗肺纖維化的一個熱點。本實驗通過免疫組織化學染色法檢測大鼠肺組織Smad2、Smad7 蛋白表達，發(fā)現(xiàn)激素、中藥、中藥+激素組均能減少Smad2 蛋白表達，以中藥組表達量最低;與模型組相比，激素組、中藥組、中藥+激素組Smad7 蛋白表達增強，以中藥組表達量最高。使用激素治療的目的主要是抑制炎癥，但在肺纖維化中后期，肺成纖維細胞過度增殖，肺組織結(jié)構(gòu)異常重塑，激素治療效果不佳，而且長期使用副作用大，這與本實驗的結(jié)果也是一致的。說明益氣養(yǎng)陰方能有效抑制TGF-β 下游信號轉(zhuǎn)導和調(diào)節(jié)分子Smad2 的表達，同時促進發(fā)揮抑制性調(diào)控效應的Smad7表達增加，證實益氣養(yǎng)陰方通過影響TGF-β/Smad 信號通路來干預治療大鼠肺纖維化。

綜上，益氣養(yǎng)陰方對博來霉素所致大鼠肺纖維化具有干預治療作用，其機制與抑制炎癥反應、減少膠原蛋白的形成和沉積及干預TGF-β/Smad 信號通路有關。

［1］Rachel G，Scheraga，Victor J，et al.Wnt/β-Catenin and transforming growth factor-β signaling in pulmonary fibrosis［J］.Ame J Res Cri Care Med，2014，190(2):129-131.

［2］楊 光，宮曉燕，張海洋，等.中藥復方抗肺纖維化機制研究［J］.吉林中醫(yī)藥，2014，34(4):430-432.

［3］蔡 杰，趙小丹，龔書識，等.中藥在實驗性肺間質(zhì)纖維化中的研究進展［J］.湖北民族學院學報，2013，30(4):67-69.

［4］Hubner RH，Gitter W，Mokhtari EI，et al.Standardized quantification of pulmonary fibrosis in histological samples［J］.Biotechniques，2008，44(4):507-517.

［5］Szapiel SV，Elson NA，F(xiàn)ulmer JD，et al.Bleomycin-induced interstitial pulmonary disease in the nude，athymic mouse［J］.Am Rev Respir Dis，1979，120(4):893-899.

［6］劉 青，何振華，張秀峰.PTEN 基因調(diào)控信號通路與肺纖維化研究進展［J］.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2014，30(5):690-693.

［7］Thrall RS，Barton RW，D'Amato DA，et al.Differential cellular analysis of bronchoalveolar lavage fluid obtained at various stages during the development of bleomycin-induced pulmonary in the rat［J］.Am Rev Respir Dis，1982，126:488-492.

［8］趙 娜，夏光濤，張源潮.成纖維細胞在特發(fā)性肺纖維化發(fā)病機制及治療中的研究進展［J］.世界臨床藥物，2013，34(7):439-442.

［9］Park SH.Fine tuning and cross-talking of TGF-beta singal by inhibitory smads［J］.J Biochem Mol Biol，2005，38(1):9-16.

［10］Park S，Ahn JY，Lim MJ，et al.IM-412 inhibits transforming growth factor beta-induced fibroblast differentiation in human lung fibroblast cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2010，399(2):268-273.

［11］曾仁鳳，何振華，張秀峰.上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化與肺纖維化的研究進展［J］.當代醫(yī)學，2014，20(2):12-13.

［12］徐慧蓉，馬小共，王獻華.肺纖維化相關細胞因子研究進展［J］.現(xiàn)代預防醫(yī)學，2011，38(10):1953-1964.