不同劑量桃仁提取物對(duì)急性胰腺炎大鼠腸道黏膜屏障功能及免疫功能的作用①

蘭 濤 李志娟 付立平 趙江橋 陳 輝

(河北省滄州市人民醫(yī)院普外二科，滄州 061000)

重癥急性胰腺炎(Severe acute pancreatitis，SAP)是腹部外科常見的急腹癥，其起病急、病程進(jìn)展快、并發(fā)癥多、治療棘手、死亡率高，占整個(gè)急性胰腺炎的10%～20%［1］。SAP 常伴有腸黏膜免疫屏障功能損傷，造成腸道細(xì)菌及內(nèi)毒素直接進(jìn)入腹腔、血液循環(huán)、淋巴系統(tǒng)，引起多種免疫炎癥介質(zhì)的失控性“瀑布樣”釋放從而導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征(Systemic inflammatory response syndrome，SIRS)和多器官功能不全綜合征(Multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，是SAP 致死的主要原因之一［2］。隨著研究的深入，炎癥免疫功能紊亂在SAP 疾病發(fā)生發(fā)展過程中的作用逐漸被認(rèn)識(shí)，免疫平衡的重要性在SAP 的治療中已逐漸受到關(guān)注［3］。桃仁為薔薇科植物Prunus persica(L)Batsch 及山桃Prunus davidiana(Carr.)Franch.的干燥成熟種子，具有鎮(zhèn)咳平喘、擴(kuò)張血管、防止動(dòng)脈粥樣硬化、抗血小板聚集、抗肝纖維化、抗癌及抗衰老等作用［4］。本課題組前期研究顯示，桃仁提取物(Persicae semen extract，PSE)對(duì)SAP 具有一定治療作用，本研究對(duì)桃仁提取物對(duì)SAP 大鼠的免疫功能和免疫屏障作用進(jìn)行研究，為進(jìn)一步擴(kuò)大桃仁在臨床的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 藥物 桃仁由本院中藥房提供。取桃仁500 g，用10 倍量蒸餾水在水浴上回流提取2 次，每次2 h，合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀處理，水浴濃縮成浸膏，120 mg 相當(dāng)于1 g 生藥，備用，臨用時(shí)用蒸餾水配制成所需濃度。

1.2 動(dòng)物 SPF 級(jí)健康SD 大鼠60 只，體重(250±20)g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.3 主要試劑 牛磺膽酸鈉、D-乳酸標(biāo)準(zhǔn)液及右旋乳酸脫氫酶，由美國Sigma 公司提供;淀粉酶測(cè)定試劑盒、二胺氧化酶試劑盒均由南京建成有限公司提供;分泌型免疫球蛋白A(Secretory immunoglobulin A，sIgA)ELISA 試劑盒由南京建成科技有限公司提供;Anti-Rat CD4 FITC、Anti-Rat CD8 PE、Anti-Rat CD25 PE 均由美國eBioscience 公司提供;紅細(xì)胞裂解液，由美國BD Pharmingen 公司提供;IgA、IgM 和IgG 試劑盒均由北京華英生物技術(shù)研究所提供;Trizol 試劑盒由美國Invitrogen 公司提供;Taq DNA聚合酶、dNTP 和模板DNA，均由武漢天維時(shí)代生物制品公司提供;SYBR Green PCR Reagents 由美國ABI 公司提供。

1.4 主要儀器 FACSAria Ⅲ型流式細(xì)胞儀由美國BD 公司提供;全自動(dòng)生化分析儀由日本Olymous 提供;Spectrum Lab 22 PC 型分光光度計(jì)由上海棱光技術(shù)有限公司提供;EXL808 全自動(dòng)酶標(biāo)儀由美國Bio-Tek 提供;ABI 7500 Real-time PCR System 由美國ABI 公司提供。

1.5 SAP 造模 每只大鼠應(yīng)用10%水合氯醛0.33 ml/100 g 進(jìn)行麻醉，上腹正中切口，暴露膽胰管，在肝門處用無損傷顯微血管夾夾閉膽胰管，用胰島素注射針由十二指腸前壁斜行進(jìn)針，經(jīng)乳頭部插入膽胰管，以0.1 ml/min 的速度勻速向膽胰管內(nèi)注入3%牛磺膽酸鈉(0.1 ml/100 g)。約10～15 min 胰腺出現(xiàn)肉眼可見的水腫出血。表明SAP 模型制作成功，松開血管夾，縫合關(guān)閉腹腔。所有大鼠術(shù)后均自由飲水飲食。

1.6 動(dòng)物分組及干預(yù) 將48 只大鼠進(jìn)行SAP 造模，造模后隨機(jī)分為模型對(duì)照組、桃仁提取物低劑量、中劑量和高劑量組，每組12 只。其余12 只大鼠作為假手術(shù)組，假手術(shù)組開腹后僅翻動(dòng)腸管和膽胰管。造模后麻醉蘇醒即開始干預(yù)，桃仁提取物低劑量組、中劑量組和高劑量組分別灌胃給予桃仁提取物0.12、0.248 和0.36 g/kg(分別相當(dāng)于藥材1、2和4 g/kg)，假手術(shù)組及模型組給予等體積蒸餾水灌胃，各組灌胃均1 次/6 h，連續(xù)4 次。

1.7 檢測(cè)指標(biāo)及方法 給藥后24 h 應(yīng)用10%水合氯醛麻醉各組大鼠，打開胸腔和腹腔，腹主動(dòng)脈分別抽取5 ml 血樣于EDTA 抗凝管和非抗凝管內(nèi)，分別應(yīng)用熒光直接標(biāo)記法和流式細(xì)胞儀進(jìn)行CD4+、CD8+和Treg 細(xì)胞測(cè)定以及采用放射免疫法測(cè)定血清IgA、IgM 和IgG，采用EPS-G7 底物法測(cè)定血清淀粉酶水平，采用酶學(xué)分光光度法檢測(cè)血清D-乳酸水平，采用活性比色法測(cè)定血清二胺氧化酶。取小腸組織進(jìn)行光學(xué)顯微鏡檢查病理學(xué)改變，采用放射免疫法進(jìn)行sIgA 測(cè)定以及采用RT-PCR 法進(jìn)行TLR4和NF-κBp65 mRNA 測(cè)定。

1.7.1 血液CD4+、CD8+和Treg 細(xì)胞的測(cè)定 取抗凝血100 μl 加入流式測(cè)定管中，分別加入5 μl Anti-Rat CD4 FITC、Anti-Rat CD8 PE、Anti-Rat CD25 PE混勻，避光常溫下孵育約15 min，加2 ml 溶血素，避光孵育約10 min，1 000 r/min 離心5 min，棄上清液，加PBS 洗2 遍，棄上清液，加入PBS 緩沖液，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個(gè)/ml，于流式細(xì)胞儀分析。采用Cell Quest 軟件分析數(shù)據(jù)，CD4+-FITC/CD25+-PE均標(biāo)記上的細(xì)胞為陽性細(xì)胞，陽性細(xì)胞與淋巴細(xì)胞之比為Treg 細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。

1.7.2 血清IgA、IgG、IgM、淀粉酶、D 乳酸和二胺氧化酶的測(cè)定 非抗凝采血管血樣室溫靜置30 min，待血液完全凝固后離心分離得血清樣本，放入-20℃冰箱保存?zhèn)錂z。取待測(cè)血清，采用免疫比濁法測(cè)定IgA、IgG 和IgM，采用EPS-G7 底物法測(cè)定血清淀粉酶水平，采用酶學(xué)分光光度法檢測(cè)血清D-乳酸水平，采用活性比色法測(cè)定血清二胺氧化酶。操作嚴(yán)格按照說明書規(guī)定進(jìn)行。

1.7.3 小腸病理學(xué)改變的觀察 取2 cm 小腸組織，經(jīng)生理鹽水輕柔沖洗腸腔，用4%多聚甲醛進(jìn)行固定，石蠟進(jìn)行包埋、切片、蘇木精和曙紅進(jìn)行染色(HE 染色)，光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.7.4 小腸黏膜中sIgA 的測(cè)定 小腸末端經(jīng)生理鹽水沖洗腸腔，取腸黏膜0.5 g，加生理鹽水0.5 ml，低溫勻漿，3 000 r/min 低溫離心10 min，取上清液進(jìn)行檢測(cè)sIgA。取上清液0.1 ml，采用免疫放射法以全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。操作嚴(yán)格按照說明書規(guī)定進(jìn)行。

1.7.5 小腸組織TLR4 和NF-κBp65 mRNA 的測(cè)定 小腸末端經(jīng)生理鹽水沖洗腸腔，取小腸組織0.2 g采用Trizol 試劑盒一步法提取組織總RNA。取RNA 樣品，用核酸分析儀進(jìn)行定量，測(cè)定260 和280 nm 的吸光度(A)值，控制A260/A280 在1.9～2.1。取RNA 逆轉(zhuǎn)錄酶，按試劑盒說明操作合成cDNA。上海生工生物工程技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成引物，引物序列和產(chǎn)物長度見表1。取RNA 樣品5 μl 于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)反應(yīng)管中，加入目的基因和βactin 引物各1.5 μl，Access QuickTMMaster Mix 12.5 μl，Nuclease-Free Water 3.5 μl，AMV Reverse Transcriptase 1 μl，構(gòu)成25 μl 的反應(yīng)體系。RT-PCR 反應(yīng)條件為:逆轉(zhuǎn)錄45℃45 min，預(yù)變性95℃ 120 s，變性95℃20 s，退火58℃20 s，延伸72℃60 s，擴(kuò)增25 個(gè)循環(huán)后延伸86℃10 s。使用基于內(nèi)參物βactin 的相對(duì)定量分析，目的基因mRNA 表達(dá)量用2-ΔΔCt計(jì)算轉(zhuǎn)錄水平的差異。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用±s 表示，兩組間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。P ＜0.05 為差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量桃仁提取物對(duì)大鼠小腸組織病理學(xué)改變的影響 假手術(shù)組大鼠小腸黏膜無顯著損傷;模型對(duì)照組大鼠小腸黏膜出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤，間質(zhì)水腫，不規(guī)則絨毛，黏膜糜爛壞死，小腸上皮細(xì)胞脫落、壞死。低劑量組大鼠小腸黏膜病理情況與模型組基本相似，中劑量和大劑量組大鼠小腸黏膜損傷顯著降低。見圖1。

2.2 不同劑量桃仁提取物對(duì)大鼠腸道黏膜屏障功能的影響 模型對(duì)照組大鼠血清淀粉酶、D-乳酸、和二胺氧化酶水平均較假手術(shù)對(duì)照組大鼠顯著升高(P＜0.01)，小腸黏膜sIgA 較假手術(shù)對(duì)照組顯著降低(P＜0.01)。桃仁提取物低劑量組和模型組大鼠血清淀粉酶、D-乳酸、二胺氧化酶和小腸黏膜sIgA差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，中劑量和高劑量組大鼠血清淀粉酶、D-乳酸和二胺氧化酶水平均較低劑量組大鼠顯著降低(P＜0.01)，小腸黏膜sIgA 較低劑量組顯著升高(P＜0.01)，并且高劑量組和中劑量組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見表2。

2.3 不同劑量桃仁提取物對(duì)血液CD4+、CD8+、CD4+/CD8+和Treg 細(xì)胞的影響 模型組大鼠血液CD4+、CD4+/CD8+較假手術(shù)組大鼠顯著降低(P ＜0.01)，CD8+、Treg 細(xì)胞較假手術(shù)組大鼠顯著升高(P＜0.01)。桃仁提取物低劑量組大鼠血液CD4+、CD8+、CD4+/CD8+和Treg 細(xì)胞與模型組大鼠差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，中劑量和高劑量組血液CD4+、CD4+/CD8+較低劑量組大鼠顯著升高(P ＜0.01)，CD8+、Treg 細(xì)胞較低劑量組大鼠顯著降低(P＜0.01)，并且高劑量組和中劑量組大鼠異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)果見表3。

圖1 各組大鼠小腸組織病理學(xué)改變的比較Fig.1 Comparison of pathological changes of small intestine in different group of rats

2.4 不同劑量桃仁提取物對(duì)血清IgA、IgG和IgM的影響 模型組大鼠血清IgA、IgG、IgM 較假手術(shù)組大鼠顯著降低(P＜0.01)。桃仁提取物低劑量組大鼠血清IgA、IgG、IgM 與模型組大鼠差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，中劑量和高劑量組血清IgA、IgG、IgM 較低劑量組大鼠顯著升高(P＜0.01)，并且高劑量組和中劑量組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)果見表4。

表1 引物序列及RT-PCR 產(chǎn)物長度Tab.1 Sequence of primer and length of RT-PCR products

2.5 不同劑量桃仁提取物對(duì)小腸組織TLR4 和NFκBp65 mRNA 的影響 模型組大鼠小腸組織TLR4和NF-κBp65 mRNA 較假手術(shù)組大鼠顯著升高(P＜0.01)。桃仁提取物低劑量組小腸組織TLR4 和NF-κBp65 mRNA 與模型組大鼠差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，中劑量和高劑量組小腸組織TLR4 和NF-κBp65 mRNA 較低劑量組大鼠顯著降低(P ＜0.01)，并且高劑量組和中劑量組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)果見表5。

表2 各組大鼠血清淀粉酶、D-乳酸、二胺氧化酶和小腸黏膜sIgA 的比較(n=12)Tab.2 Comparison of amylase，D-lactic acid，diamine oxidase in serum and sIgA in mucous membrane of small intestine in different group of rats (n=12)

表3 各組大鼠治療后CD4+、CD8+、CD4+/CD8+和Treg 細(xì)胞的比較(n=12)Tab.3 Comparison of CD4+，CD8+，CD4+/CD8+ and Treg cell in different group of rats (n=12)

表4 各組大鼠治療后血清IgA、IgG 和IgM 的比較(n=12)Tab.4 Comparison of IgA，IgGand IgM in different group of rats (n=12)

表5 各組大鼠治療后小腸黏膜sIgA 以及小腸組織TLR4和NF-κBp65 mRNA 的比較(n=12)Tab.5 Comparison of sIgA in intestinal mucosa，TLR4 and NF-κBp65 mRNA in intestinal tissue in different group of rats (n=12)

3 討論

SAP 是外科最為兇險(xiǎn)的急腹癥之一，具有起病急、發(fā)展快、并發(fā)癥多、預(yù)后差的特點(diǎn)。研究顯示腸黏膜屏障功能的破壞是SAP 發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵點(diǎn)之一，腸黏膜屏障高通透性導(dǎo)致腸道細(xì)菌和內(nèi)毒素易位，與SAP 時(shí)胰腺壞死組織繼發(fā)細(xì)菌感染密切相關(guān)，是SAP 高致死率的主要原因［5］。桃仁是祖國醫(yī)學(xué)活血化瘀要藥，現(xiàn)代研究亦表明桃仁對(duì)心腦血管疾病療效顯著，近年來受到廣泛關(guān)注。研究表明，桃仁提取物能改善不同病因所致大鼠的血液循環(huán)障礙［6］。但是，目前針對(duì)桃仁治療急性胰腺炎的作用目前尚未有報(bào)道。

血清淀粉酶是急性胰腺炎診斷中最常用的生化標(biāo)志物。D-乳酸是細(xì)菌發(fā)酵的代謝產(chǎn)物，當(dāng)腸道通透性增加時(shí)大量D-乳酸通過受損黏膜入血［7］。二胺氧化酶是腸黏膜上層絨毛細(xì)胞胞質(zhì)中具有高度活性的細(xì)胞內(nèi)酶，當(dāng)腸黏膜細(xì)胞受損、壞死后該酶釋放入血［8］。sIgA 是構(gòu)成腸道免疫屏障功能的主要組成物質(zhì)，研究表明［9］sIgA 分泌減少可降低腸道抵御細(xì)菌和毒素入侵的能力，并且易激活細(xì)胞炎性因子，產(chǎn)生過度炎性反應(yīng)，進(jìn)一步損害腸黏膜。桃仁提取物0.248g/kg 和0.36g/kg 可顯著降低SAP 大鼠小腸黏膜病理損傷以及血清淀粉酶、D-乳酸和二胺氧化酶水平(P＜0.01)，并且增加小腸黏膜sIgA 水平(P＜0.01)，說明桃仁提取物可以通過降低腸道黏膜通透性、改善腸道免疫屏障功能而起到保護(hù)SAP 大鼠腸道黏膜的作用。

多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，SAP 患者細(xì)胞免疫功能低下是其發(fā)生感染并發(fā)癥及死亡率高的原因。外周血T淋巴細(xì)胞及其亞群分析是公認(rèn)的反映機(jī)體細(xì)胞免疫狀態(tài)的較好指標(biāo)。SAP 時(shí)外周血淋巴細(xì)胞總數(shù)及CD4+/CD8+比值下降與疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，上調(diào)CD4+/CD8+可增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能［10］。本研究結(jié)果顯示，桃仁提取物中劑量和高劑量組CD4+/CD8+比值較低劑量組顯著升高(P＜0.01)，說明桃仁提取物可顯著改善SAP 大鼠細(xì)胞免疫功能。此外，桃仁提取物中劑量和高劑量組IgG、IgA 和IgM水平較低劑量組顯著升高(P＜0.01)，說明桃仁提取物也可改善SAP 大鼠的體液免疫功能。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulation T cell，Treg)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類具有獨(dú)特負(fù)向免疫調(diào)控作用的T 細(xì)胞亞群，Treg 細(xì)胞水平一定程度上成為反映SAP 損傷嚴(yán)重程度的敏感指標(biāo)［11］。本研究結(jié)果顯示，桃仁提取物中劑量和高劑量組Treg 細(xì)胞水平較低劑量組顯著降低(P＜0.01)，說明桃仁提取物可顯著降低SAP 大鼠的Treg 細(xì)胞水平。

固有免疫是機(jī)體抵抗有害刺激的第一線，作為固有免疫的中心受體即Toll 樣受體(Toll-like receptors，TLRs)家族已成為研究SAP 發(fā)病機(jī)制的熱點(diǎn)［12］。TLR4 是目前研究最多的TLRs，是先天性免疫的門戶蛋白，TLR4 在SAP 的發(fā)病早期就參與了機(jī)體免疫反應(yīng)最終觸發(fā)的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致SAP惡化［13］。NF-κB 是一種前炎癥介質(zhì)基因核因子，也是一種具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的核蛋白，參與調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄過程［14］。當(dāng)TLRs 被外源性或者內(nèi)源性配體激活后，通過一系列的信號(hào)級(jí)聯(lián)激活NF-κB 轉(zhuǎn)位進(jìn)入胞核，啟動(dòng)諸多細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，激活多種與炎癥有關(guān)的細(xì)胞因子、黏附分子，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生［15］。本研究結(jié)果顯示，桃仁提取物0.248g/kg 和0.36g/kg 可顯著降低SAP 大鼠小腸組織TLR4 和NF-κBp65 mRNA(P＜0.01)，說明桃仁提取物可抑制SAP 大鼠的TLR4/NF-κB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并且作用具有劑量依賴性。

總之，桃仁提取物對(duì)急性胰腺炎大鼠腸道屏障功能具有保護(hù)作用，并且顯著改善急性胰腺炎大鼠的免疫功能。

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