不完全弗氏佐劑誘導的髓樣細胞抑制T 細胞活性①

劉雨晴 尹寶靚 姚毅波 王子兵③ (新鄉醫學院第三附屬醫院腫瘤科，新鄉 453003)

長期以來，腫瘤疫苗是免疫治療領域研究的重要內容之一，然而臨床或臨床前的試驗結果顯得不甚理想［1］。為了最大限度提高癌癥疫苗的療效，目前大多數研究致力于選擇合適的腫瘤抗原、優化抗原肽與提高抗原提呈細胞及T 細胞之間的相互作用和阻斷腫瘤誘導的免疫抑制機制［2-4］。然而，作為疫苗的重要組成成分之一的佐劑卻沒有引起足夠的重視。到目前為止，人們仍然不清楚腫瘤疫苗療效不佳的原因是否與佐劑使用不當有關。在本項研究中，我們發現腫瘤疫苗研究中最常用的IFA 能夠誘導一群具有免疫抑制作用的髓樣細胞。

1 材料與方法

1.1 小鼠和細胞系 BALB/c 小鼠(6～8 周)購自維通利華(北京)。所有小鼠均飼養于中科院生物物理研究所SPF 級動物房。TSA 細胞系來自BALB/c 小鼠，用含10% NCS 的RPMI1640 培養基培養。

1.2 流式細胞檢測 用兩片載玻片磨脾，用PBS懸起，用金屬網過濾，用紅細胞裂解液裂解，將得到的細胞沉淀重懸于含2%小牛血清的PBS 溶液中，4℃，1 500 r/min 離心5 min，收集細胞;加入熒光標記的抗體溶液，冰上避光孵育30 min;FACS Buffer洗去多余的抗體，將細胞重懸于300 μl FACS Buffer中;FACSCalibur 檢測樣品熒光。

1.3 CD11b+細胞分離 分離CD11b+細胞時，將5×106～6×106個脾細胞懸于PBS，然后與5 μg生物素化的Anti-CD11b mAb 共同孵育15 min。用PBS 洗滌兩次后與鏈酶親和素磁珠4℃孵育15 min。然后用MiniMACS 柱分離CD11b+細胞。

1.4 細胞增殖能力分析 將正常小鼠的脾細胞鋪到96 孔板上，用Con A 作為刺激源，然后加入PBS或IFA 注射后第7、14 和21 天時從對照小鼠(PBS處理)或IFA 處理小鼠脾臟中分離的CD11b+細胞培養。72 h 后向各孔中加入四甲基偶氮唑藍(MTT)，在37℃培養箱中繼續培養4 h，去掉上清，向各孔中加入二甲基亞砜。495 nm 處讀取吸光度值。結果以相對OD 值進行計算，其計算方法是:每個孔檢測值/不含CD11b+細胞孔的平均OD 值。

1.5 細胞因子檢測 將TSA 腫瘤細胞用γ 射線照射，然后免疫小鼠，14 d 之后制備脾單細胞懸液，以2 × 106/孔的濃度鋪到24 孔板上，然后向各個孔中加入照射的TSA 細胞進行刺激(與脾細胞的比例為1 ∶40)。為了評價CD11b+細胞對IFN-γ 分泌量的影響，在上述體系中分別加入4 × 105個PBS 或IFA注射后第14 天時取得的對照組小鼠或IFA 免疫小鼠的CD11b+細胞。培養3、5 和7 d 后，使用ELISA試劑盒檢測上清中的IFN-γ 量。收集上清，檢測細胞因子IFN-γ 的分泌量。

2 結果

2.1 IFA 可誘導CD11b+細胞產生 根據我們以前的研究，單次注射CFA 可誘使小鼠脾臟增大，脾細胞總數增加［5］。對大顆粒細胞進行分析發現，IFA處理的小鼠脾臟中CD11b+細胞明顯增多。對這群細胞進行進一步分析發現，大多數CD11b+細胞都表達Gr-1 分子，并且Gr-1 分子的熒光強度明顯小于對照組(圖1)。

2.2 CD11b+細胞低表達MHCⅠ類分子 我們接著比較了PBS 處理組和IFA 處理組CD11b+細胞的分子表型區別。與正常小鼠，相比接受IFA 處理的小鼠脾臟中CD11b+細胞上CD80、CD69、CD54、CD106和CD11c 的表達沒有明顯不同(結果未顯示)，但組織相容性抗原復合物分子H2-Kd的表達明顯降低(圖2)。

圖1 IFA 處理的小鼠脾臟中CD11b+細胞增多Fig.1 Increased CD11b+ cells in spleen of IFAtreated mice

圖2 IFA 誘導的CD11b+細胞MHCⅠ類分子表達水平降低Fig.2 Low level expression of MHCⅠmolecule in IFAinduced CD11b+ cells

圖3 IFA 誘導的CD11b+細胞抑制T 細胞增殖Fig.3 IFA-induced CD11b+ cells inhibit T cell proliferation

圖4 IFA 誘導的CD11b+細胞抑制IFN-γ 的產生Fig.4 IFA-induced CD11b+ cells inhibit IFN-γ production

2.3 CD11b+細胞抑制T 細胞增殖 為了確定IFA誘導的CD11b+細胞是否直接影響T 細胞增殖，將制備好的正常小鼠來源的脾細胞與IFA 誘導的CD11b+細胞共同孵育，并使用Con A 作為T 細胞增殖的刺激劑。結果顯示，與對照組相比，IFA 誘導的CD11b+細胞提示能夠明顯抑制T 細胞增殖(圖3)。

2.4 CD11b+細胞抑制T 細胞產生IFN-γ IFN-γ主要是血源性細胞分泌［6，7］，與腫瘤的排斥密切相關。將從TSA 細胞免疫后小鼠分離的脾細胞與從PBS 或IFA 免疫小鼠分離的CD11b+細胞共同培養，然后用照射后的TSA 細胞作為刺激原進行刺激。培養第5 天和第7 天檢測發現，TSA 免疫脾細胞(主要是T 細胞)能產生大量的IFN-γ。當加入IFA 誘導的CD11b+細胞后，免疫脾細胞分泌IFN-γ 的量大大減少。這些結果表明，CD11b+細胞能夠抑制IFNγ 的產生。

3 討論

佐劑是腫瘤疫苗的重要組成部分。然而，佐劑是怎樣影響疫苗的治療效果還不是很清楚。前期的研究發現，完全弗氏佐劑(CFA)和IFA 均可誘導小鼠產生CD11b+細胞，并且CFA 誘導的這群細胞能夠通過抑制T 細胞產生IFN-γ 和促進T 細胞凋亡而發揮免疫抑制作用，但沒有對IFA 誘導的該群細胞進行進一步的研究［5］。本項研究發現，IFA 誘導的CD11b+細胞同樣具有免疫抑制功能。這些發現有助于解釋使用弗氏佐劑的腫瘤疫苗為什么臨床效果總是不佳，從而強調了腫瘤主動免疫治療時佐劑選擇的重要性。

IFA 誘導的CD11b+細胞與腫瘤誘導的骨髓來源的抑制性細胞(MDSC)有許多共同特征。例如，它們都表達CD11b 和Gr-1［8，9］。然而，它們之間仍有一些差異存在。表型上，CD11b+細胞較少表達MHC Ⅰ類分子。在功能上，CD11b+細胞抑制Con A誘導的T 細胞增殖，抑制腫瘤抗原誘導的T 細胞分泌IFN-γ。關于抑制機制仍需要更多的研究證實。

我們的發現具有重要的臨床意義。其中一點就是體內阻斷CD11b+的生成或者功能可能會阻斷疫苗中弗氏佐劑的破壞作用。有意思的是，體外已有研究證明干擾其功能可減輕腫瘤誘導的MDSC 對T細胞的抑制作用、恢復T 細胞功能和部分恢復抗腫瘤免疫效果［10］。這一結果指出了一種可以改善腫瘤免疫效果的方法。

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