漢黃芩素提高人CD3AK 細胞殺傷肝癌細胞的實驗研究和機理探討①

李曉楠 姬會春 周 燏 鄭 璐 劉軍權 朱月華

(徐州醫學院附屬醫院西院 中煤五公司職工醫院，徐州 221006)

漢黃芩素是唇形科植物黃芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的主要活性化合物之一。許多研究發現其具有顯著的抗炎、抗病毒、神經保護和抗腫瘤作用。用CD3 單克隆抗體和多種細胞因子聯合誘導培養的人外周血單個核細胞(CD3AK 細胞)是已知最有效的抗腫瘤免疫效應細胞之一。劉軍權等［1］報道，用CD3 單抗和多細胞因子聯合活化的殺傷細胞對SGC-7901、SW-1990 和SW-1116 細胞殺傷活性明顯高于常規的細胞因子誘導殺傷細胞(CIK 細胞)。本研究在預試驗中發現，漢黃芩素不僅對肝癌細胞有直接抑制作用，還能提高CD3AK細胞增殖和增強殺傷肝癌細胞株SMMC-7721 的功能。但漢黃芩素對提高CD3AK 細胞增殖和功能的具體機制尚不清楚。因此，本研究擬用不同濃度的漢黃芩素對人CD3AK 細胞和肝癌細胞株進行體外誘導試驗，以研究其可能機制。根據實驗結果也可為漢黃芩素的臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 漢黃芩素(BetA)(美國Sigma 公司，純度﹥99%);人肝癌細胞株SMMC-7721(上海細胞生物研究所);四甲基偶氮唑藍(Methlthiazolyl tetrazolium，MTT)和二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide DMSO)(Sigma 公司);淋巴細胞分離液(中國科學院血液病研究所);IL-1α、IL-2、IL-18(廈門特寶生物公司);IL-15 和IL-21(購自R＆D 公司);CD3 單抗(上海免疫研究所);CD28 單抗(蘇州大學生物技術研究所);IFN-γ 購于Abender 公司;胰蛋白酶、RPMI1640、小牛血清(均購自Gibco 公司);人AB 血清(徐州市血站);PerCP-Cy5.5 標記的CD3、FITC 標記的CD56、PE 標記的穿孔素(Pore-forming protein，PFP)、顆粒酶B (Granzyme B，GrB)、APC 標記的CD107a (聯科生物有限公司);兔抗人ERK1/2 單克隆抗體(購自美國CST 公司);乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒(日本世諾臨床診斷制品株式會社);垂直式電泳裝置、電轉移槽(北京希亞克技術有限公司);BCA 蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術研究所);ST-360 酶標儀(上海科華實驗系統有限公司);Encore 自動生化分析儀(北京希亞克技術有限公司;熒光倒置顯微鏡TE2000-S(日本Nikon 公司);流式細胞儀(美國BD公司);流式細胞儀分析軟件CellQuest，每個標本分析細胞數≥1×104。

1.2 實驗方法

1.2.1 人CD3AK 細胞的培養和鑒定 取健康供者外周血10 ml，用淋巴細胞分離液分離單個核細胞(1 500 r/min，離心15 min)，取單個核細胞層用生理鹽水洗滌3 次(1 800 r/min，8 min/次)，用RPMI 1640 培養液調整細胞密度為5×108L-1，接種于細胞培養瓶中，每瓶15 ml，同時加入相應的細胞因子(IL-1α 10 μg/L、rhIL-2 5×104U/L、CD3 mAb 1 mg/L、IL-15 20 μg/L、IL-18 10 μg/L、IL-21 10 μg/L 和CD28 mAb 10 mg/L)，置37℃、50 ml/L CO2環境培養，每2 d 半量換培養基(含相應的細胞因子)1 次，并調整細胞密度為5×108L-1。收集培養7 d 的細胞進行細胞表面標志檢測及相關實驗。

1.2.2 不同濃度的漢黃芩素對CD3AK 細胞增殖的測定 將培養成功的CD3AK 細胞配成2×107L-1細胞懸液加入96 孔板，每孔180 μl，每組設5 個復孔，同時設陰性對照組，實驗組分別加入不同濃度的漢黃芩素(濃度分別至0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.1、6.25、12.5、25、50、100 mg/L)，于培養箱中培養24、48、72 h;在培養結束前4 h 每孔加入CCK-8 10 μl，繼續分別培養2、4、6 h 后在酶標儀450 nm 處檢測各孔吸光值(OD)，并記錄結果。

1.2.3 漢黃芩素對肝癌細胞株生長的影響 取對數生長期的SMMC-7721 細胞配成3×107L-1的細胞懸液加入96 孔板，每孔180 μl，每組設5 個復孔，同時設陰性對照組;將培養板放入37℃、50 ml/L 培養箱培養24 h 后，實驗組分別加入不同濃度的漢黃芩素(濃度分別至0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.1、6.25、12.5、25、50、100 mg/L)，于培養箱中培養72 h;在培養結束前4 h 加入MTT 20 μl/孔，繼續培養4 h 后棄去上清，加入DMSO 150 μl，使甲瓚完全溶解，于酶標儀495 nm 處檢測各孔吸光值(OD)記錄結果。細胞抑制率IR(%)=(對照OD 值)-(實驗OD 值)/(對照OD)×100%。相同實驗重復3 次，取平均值。

1.2.4 FCM 檢測漢黃芩素作用后的CD3AK 細胞中GrB、IFN-γ、PFP、CD107a 的表達 根據用CCK-8方法對漢黃芩素作用CD3AK 細胞的實驗結果，選擇終濃度分別為0.2、0.8、3.1、12.5、50 mg/L 的漢黃芩素進行CD3AK 細胞誘導實驗。收集經藥物誘導48 h 和CD3AK 細胞，洗滌1 次后將細胞調整密度為1×1010L-1，取其100 μl 細胞懸液加入PerCPCy5.5 標記的CD3 抗體20 μl，室溫避光孵育30 min，PBS 洗滌，加入100 μl 破膜劑A，室溫避光孵育15 min，PBS 洗滌，加入100 μl 破膜劑B，同時分別在試管中加入anti-GrB-PE 和anti-PFP-PE 各5 μl，設置同型對照抗體管，共同孵育15 min，PBS 洗滌后，加入PBS 500 μl，流式細胞儀檢測GrB 和PFP百分數;另取經漢黃芩素作用后的CD3AK 細胞，調整細胞數至1×1010L-1，取100 μl 細胞懸液，加入PerCP-Cy5.5 標記的CD3 抗體20 μl，室溫避光孵育30 min，PBS 洗滌，加入APC 標記的鼠抗人anti-CD107a 5 μl，同時設同型對照抗體管，流式細胞儀術測定CD3AK 細胞中CD107a 的百分數。

1.2.5 檢測漢黃芩素作用后的CD3AK 細胞對肝癌細胞株SMMC-7721 殺傷活性 按劉軍權等［2］方法，取經不同濃度漢黃芩素誘導48 h 后的CD3AK 細胞配成2×109L-1，取對數生長期靶細胞SMMC-7721配成2×108L-1的細胞懸液，用RPMI1640 培養基洗滌3 遍，將效靶細胞按10 ∶1比例混合，以500 r/min離心5 min，置37℃、50 ml/L CO2孵箱中孵育6 h后，輕輕混勻細胞，再以1 500 r/min 離心10 min。收集上清液在全自動生化分析儀(Olympus AU1000)340 nm 波長下測定光密度(A)。相同實驗重復3 次，取平均值。殺傷活性(%)=(A 實驗組-A 效應細胞自然釋放組)/(A 靶細胞最大釋放組-A 靶細胞自然釋放組)×100%。

1.2.6 Western blot 檢測漢黃芩素作用前后CD3AK細胞p-ERK 表達的變化 取培養7 d 的CD3AK 細胞，配成5×108L-1細胞懸液，分別接種于6 孔板，3 ml/孔，加入漢黃芩素(終濃度分別至50、12.5、3.2、0.8 和0.2 mg/L)，同時設置不加漢黃芩素對照組。繼續培養48 h 后，加細胞裂解液500 μl 裂解細胞，提取蛋白，Forlin 檢測蛋白濃度，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、轉膜、封閉2 h，一抗孵育:加入新鮮配制的1 ∶500 稀釋鼠抗人p-ERK1/2 抗體，置于4℃冰箱過夜;二抗孵育:加入1 ∶1 000 稀釋的堿性磷酸酶標記馬抗鼠IgG，將濾膜浸入NBT/BCIP 顯色液，終止反應后取出條帶晾干，ODSEEY 上機掃描。用Image J 圖像分析軟件進行分析。

1.2.7 侵襲實驗(Invasion assay) 按實驗設計分為對照組和50、12.5、3.2、0.8、0.2 mg/L 漢黃芩干預組。取對數生長期的SMMC-7721 細胞，調整密度為1.0×108L-1，吸取200 μl 細胞懸液加入24 孔侵襲小室(transwell chambers)的上室，下室緩慢加入500 μl 培養基，37℃、50 ml/L CO2培養箱中孵育48 h，取出小室用RPMI1640 洗滌3 次，用棉球擦去上室面的細胞，下室面用無水乙醇固定10 min，PBS 漂洗后用0.1%的結晶紫染色10 min，PBS 漂洗3 次。顯微鏡下計數穿過transwell 小孔的細胞，觀察5 個視野并拍照，實驗重復3 次。侵襲抑制率(IR)=(1-實驗組侵襲細胞數/對照組侵襲細胞數)×100%。

1.2.8 劃痕愈合實驗(Wound healing assay) 將對數生長期的肝癌細胞SMMC-7721 用含10%胎牛血清的RPMI1640 培養基培養，加入6 孔細胞培養板中，當SMMC-7721 細胞生長融合達到90% 時，用200 μl 的移液器槍頭，在培養板每孔中央的縱軸方向劃痕，吸去原培養基，用RPMI1640 培養基洗2次，去除劃痕區的漂浮細胞。每孔加入10%胎牛血清的RPMI1640 培養基培養5 ml，然后分別加入終濃度為50、12.5、3.2、0.8、0.2 mg/L 漢黃芩素，37℃、50 ml/L CO2恒溫培養箱中孵育，在培養0、24、48 h 時分別于倒置顯微鏡下觀察細胞融合生長情況并拍照，每組設3 個復孔，實驗重復3 次。

1.3 統計學方法 采用SPSS16.0 軟件進行數據處理，數據均以±s 表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 藥物誘導前后CD3AK 細胞形態學觀察及純度檢測 CD3AK 細胞經不同濃度漢黃芩素誘導后，顯微鏡下可見CD3AK 細胞體積增大，成圓形或橢圓形，胞膜光滑，細胞數量增多，部分形成集落，FCM檢測此濃度下CD3AK 細胞表型，顯示CD3+CD56+比率達30.5%，結果見圖1、2。

2.2 漢黃芩素對CD3AK 細胞增殖的影響 CD3AK 細胞經不同濃度漢黃芩素誘導后，其細胞增殖率出現明顯變化，在0.025～25 mg/L 濃度范圍內，漢黃芩素能明顯促進CD3AK 細胞增殖，漢黃芩素濃度為3.2 mg/L 時細胞增殖率最明顯，與對照組(0 mg/L)比較有統計學差異(P＜0.05)，結果見圖3。

2.3 MTT 法檢測漢黃芩素對SMMC-7721 細胞生長的影響 經濃度為0.8～100 mg/L 漢黃芩素作用72 h 后的SMMC-7721 細胞與對照組比較均有明顯的抑制作用，兩者比較有統計學差異(P＜0.05)，結果見圖4。

圖1 培養前后顯微鏡下CD3AK 細胞形態(×400)Fig.1 Morphology of human CD3AK cells under microscope after Wogonin induced 48 h (×400)

圖2 PBMC 培養前后CD3AK 細胞表型分析Fig.2 Phenotype analysis of human CD3AK cells after Wogonin-induced

圖3 漢黃岑素對CD3AK 細胞生長的影響Fig.3 Effect of Wogonin on proliferation of CD3AK cells

圖4 不同濃度漢黃岑素對SMMC-7721 細胞生長的影響Fig.4 Effect of Wogonin on proliferation of SMMC-7721

2.4 漢黃芩素對CD3AK 細胞顆粒酶B、穿孔素和CD107a 表達的影響 經0.4～50 mg/L 漢黃芩素作用48 h 后的CD3AK 細胞，其顆粒酶B、穿孔素及CD107a 的表達均有所上調。當漢黃芩素濃度為3.2 mg/L 時，顆粒酶B、穿孔素及CD107a 分別為76.9%、30.5%和83.6%，顯著高于對照組(分別為65.4%、25.1%和75.3%)，與對照組比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。結果見表1、圖5。

2.5 漢黃芩素對CD3AK 細胞殺傷肝癌SMMC-7721細胞活性的影響 實驗結果顯示，濃度為0.2～6.2 mg/L 漢黃芩素作用48 h 后的CD3AK 細胞，對SMMC-7721 細胞的殺傷活性顯著高于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)。在3.2 mg/L 時殺傷活性達最高(60.4%)，與對照組(漢黃芩素為0 mg/L)比較差異有統計學意義(P＜0.05)。漢黃芩素濃度高于6.2 mg/L 時，殺傷活性隨濃度增高逐漸降低，當濃度為25 mg/L 時，可抑制CD3AK 細胞對SMMC-7721 細胞的殺傷活性(P＜0.05)，結果見圖6。

表1 漢黃芩素對CD3AK 細胞顆粒酶B、穿孔素、CD107a表達的影響Tab.1 Effect of Wogonin on expression of GrB，PFP and CD107a

圖5 3.2 mg/L 漢黃芩素誘導后CD3AK 細胞顆粒酶、穿孔素和CD107a 的表達Fig.5 Expression of perforin，GrB and CD107a of CD3AK cells induced by 3.2 mg/L Wogonin

2.6 漢黃芩素對CD3AK 細胞ERK1/2 表達的影響不同濃度漢黃芩素作用48 h 后的CD3AK 細胞其ERK1/2 蛋白表達較對照組均有所上調，濃度在12.5～0.8 mg/L 時，ERK1/2 蛋白表達均高于對照組，以3.2 mg/L 最明顯，差異有統計學意義(P ＜0.05)，結果見圖7、8。

2.7 劃痕愈合實驗(Wound healing assay) 經濃度為50、12.5、3.2、0.8、0.2 mg/L 漢黃芩素誘導48 h后，肝癌細胞SMMC-7721 的融合率以3.2 mg/L 時最低，與對照組比較有統計學意義。其他漢黃芩濃度組誘導的SMMC-7721 融合率也較對照組低。結果見圖9。

2.8 侵襲實驗(Invasion assay) 經濃度為50、12.5、3.2、0.8、0.2 mg/L 漢黃芩素誘導48 h 后，肝癌細胞SMMC-7721 通過transwell 小孔細胞數以漢黃芩素濃度為12.5 mg/L 時最低;濃度在12.5～0.8 mg/L 時，細胞穿過率也低于對照組，各漢黃芩素誘導組SMMC-7721 細胞穿過率與對照組比較均有統計學差異，藥物誘導的各組侵襲抑制率均低于對照組。結果見圖10。

圖6 經漢黃芩素誘導后的CD3AK 細胞對SMMC-7721殺傷活性Fig.6 Cytotoxicity of CD3AK cells treated by Wogonin

圖7 漢黃芩素誘導48 h 后CD3AK 細胞ERK1/2 的表達Fig.7 Expression of ERK1/2 induced by Wogonin for 48 h

圖8 漢黃芩素誘導48 h 后CD3AK 細胞ERK1/2 的表達Fig.8 Expression of ERK1/2 after treated by Wogonin for 48 h

圖9 3.2 mg/L 漢黃芩素誘導后SMMC-7721 細胞融合結果比較Fig.9 Wound healing assay result of SMMC-7721 after treated by 3.2 mg/L Wogonin

圖10 12.5 mg/L 漢黃芩素誘導后SMMC-7721 細胞穿過率結果比較Fig.10 Invasion assay result of SMMC-7721 treated by 12.5 mg/L Wogonin

3 討論

肝癌是指肝細胞或肝內膽管細胞發生的惡性腫瘤，是惡性程度及轉移率很高的腫瘤之一，其發病率位居各種腫瘤的第5 位［3］。漢黃芩素是唇形科植物黃芩主要的活性化合物之一，存在于植物的根莖中，屬于黃酮類化合物，在體內和體外都具有顯著抗炎、抗病毒、神經保護和抗腫瘤作用。國內外許多研究發現，漢黃芩素具有顯著抑制人卵巢癌細胞A2780、人肝癌細胞SK-HEP-1、人乳腺癌細胞等的作用;另外應用腫瘤致死劑量的漢黃芩素對正常免疫細胞無沒有毒性;動物試驗也進一步證實，漢黃芩素對荷載腫瘤的動物有效治療劑量對動物無毒副作用［4-8］。因此對漢黃芩素的進一步研究具有重要意義。目前國內外少有應用漢黃芩素提高CD3AK 細胞殺傷肝癌細胞研究的報道。也無應用漢黃芩素提高免疫效應細胞殺傷腫瘤敏感性的研究。為此本課題從漢黃芩素抑制肝癌細胞轉移相關分子(細胞遷移、Ezrin蛋白等)、漢黃芩素提高CD3AK 細胞增殖和殺傷腫瘤活性的作用機理及漢黃芩素提高CD3AK 細胞對肝癌細胞殺傷敏感性等途徑進行系列研究。

CD3AK (anti-CD3 antibody induced activated killer cells)是指在體外用抗人CD3 單克隆抗體和IL-2 等細胞因子激活的殺傷細胞。CD3AK 細胞是以CD3+CD8+T 為主的異質群細胞，有增殖速度快、殺瘤活性高、殺瘤譜廣、在體內分泌細胞因子能力強以及臨床應用安全性高及低毒副作用等優勢［9-13］，已成為腫瘤細胞免疫治療的重要效應細胞之一。在免疫原性強的腫瘤病人體外培養的CD3AK 細胞中可有一定數量的腫瘤抗原特異性細胞毒T 細胞。

PFP 是一種糖蛋白，能以鈣離子依賴方式在靶細胞膜上形成穿孔素管狀通道，進而導致靶細胞滲透性溶解破壞［14］。GraB 是具有天冬氨酸酶活性的絲氨酸蛋白酶，它能夠通過caspase 依賴途徑、不依賴caspase 的胞質途徑及直接入核途徑殺傷靶細胞［15］。CD107a 分子是抗原特異性細胞活化以后的脫顆粒過程密切相關蛋白，是殺傷性T 細胞脫顆粒以后，細胞溶解性顆粒的胞膜與T 細胞膜融合的證據［16］。本研究FCM 結果顯示，濃度為0.8～3.2 mg/L 的漢黃芩素作用后，CD3AK 細胞表面的PFP、GraB 和CD107a 的表達率均明顯高于對照組(P ＜0.05)，提示上述濃度的漢黃芩素能夠上調細胞PFP 和GraB 的表達，當漢黃芩素濃度為50 mg/L時，PFP 的表達率低于對照組(P＜0.05)，提示高濃度的漢黃芩素能夠下調CD3AK 細胞的功能。本實驗表明，濃度為0.2～6.2 mg/L 的漢黃芩素作用CD3AK 細胞48 h 后，對肝癌SMMC-7721 細胞株細胞的殺傷活性隨著漢黃芩素濃度的增加而逐漸增強，濃度為3.2 mg/L 時達峰值，大于6.2 mg/L 時，其殺傷活性呈下降趨勢，提示漢黃芩素對CD3AK細胞的作用存在濃度窗現象。

細胞外信號調節激酶1/2(ERK1/2)是ERK 家族的重要成員，其活化形式是磷酸化細胞外信號調節激酶(p-ERK)，通常認為ERK 磷酸化代表ras/raf/MAPK 信號通路的活化。胞外刺激可經G 蛋白受體、生長因子受體和酪氨酸蛋白激酶受體，經Ras-Raf-MEK-ERK 級聯信號激活ERK，通過影響下游效應分子的活性，在細胞的活化、增殖和凋亡中起著重要作用［17，18］。我們的實驗研究發現，漢黃芩素濃度在12.5～0.8 mg/L 時，ERK1/2 蛋白表達高于對照組，提示漢黃芩素能夠上調細胞中p-ERK1/2的表達，考慮為漢黃芩素激活細胞的ras/raf/MAPK 信號通路，進而引起CD3AK 細胞的增殖。當漢黃芩素濃度達50 mg/L 時，細胞p-ERK1/2 蛋白的表達量較0.15～10 mg/L 時低，考慮為高濃度的漢黃芩素對CD3AK 細胞產生抑制作用，可能為p-ERK1/2 與CD3AK 細胞凋亡有關。漢黃芩素影響CD3AK 細胞增殖和體外殺傷活性的具體機制目前尚不清楚，推測可能與胞內信號通路的異?；罨嘘P。T 細胞活化時信號傳遞由T 細胞表面抗原識別受體(T cell receptor，TCR)介導，外來信號經受體及相關蛋白傳遞給胞內的蛋白酪氨酸激酶，此后啟動三條下游信號途徑:一為磷脂酶 C-γ1(PhospholipaseC-γ1，PLC-γ1)介導的信號途徑，二為Ras-MAPK 途徑，三為共刺激分子介導的磷酸肌醇激酶-3(PI3K)輔助信號途徑。這3 條途徑中都存在一個非常重要的環節:活化信號要依靠激活的ZAP-70 磷酸化接頭蛋白LAT 和SLP-76 進行進一步的傳遞。有研究發現，LAT 經酪氨酸激酶活化后，與SLP-76 通過Gads 結合成復合體，募集連接PLCγ1、Vav、PI3K、Itk 以及Sos 等多種重要的信號傳導分子，形成以LAT 為核心的信號轉導復合體，激活T細胞活化信號傳導的下游途徑(磷酯酰肌醇途徑和Ras-MAPK 途徑)。ERK1/2 位于胞漿內，其信號通路被認為是經典的絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase，MAPK)信號通路，一旦被激活，能迅速穿過核膜并通過磷酸化反應調節某些轉錄因子的活性，引起特定蛋白的表達或活性改變，與細胞生長發育、炎癥、應激和病毒的感染復制等過程密切相關［19-21］。這些研究顯示轉錄因子NF-AT、AP-1、NF-κB 可能是ERK1/2 信號通路影響T 淋巴細胞活化、增殖、凋亡等生物學行為的關鍵環節。

CD3AK 細胞是腫瘤治療的免疫效應細胞之一，具有廣闊應用前景。細胞免疫治療的療效的關鍵是能否培養出高度免疫活性的抗腫瘤效應細胞。因此如何獲得足夠數量并具有高細胞毒活性的效應細胞已成為CD3AK 細胞治療成功的關鍵。本實驗證實漢黃芩素能激活ERK1/2 信號通路促進CD3AK 細胞增殖，并通過提高免疫效應細胞的顆粒酶B、穿孔素及CD107a 的表達提高其殺傷活性。同時漢黃芩素還能直接抑制肝癌細胞SMMC-7721 生長，減少SMMC-7721 細胞的遷移率，減緩SMMC-7721 細胞生長融合時間。這些結果為漢黃芩素的臨床應用提供了一定的實驗依據。

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