Bcl-6/Blimp-1/IL-21 在原發性干燥綜合征中的致病作用

段春巧 楊雯雯 雷玲彥 郭惠芳 張明峰 高麗霞 孫 超

(河北醫科大學第二醫院免疫風濕科，石家莊 050017)

Bcl-6(B cell lymphoma 6)屬于抗細胞凋亡的原癌基因，表達于T、B 淋巴細胞中。當T、B 細胞受到抗原及細胞因子刺激后，促進Bcl-6 的表達，從而加速生發中心的形成［1］，轉錄因子Blimp-1 (B lymphocyte induced maturation protein 1，Blimp-1)與Bcl-6 是一對相互拮抗的轉錄調節因子，而細胞因子IL-21 與Bcl-6 對生發中心的形成具有協同作用。原發性干燥綜合征(Primary Sj?gren's syndrome，PSS)是以唇腺組織過量的淋巴細胞浸潤形成生發中心為主要病理特征，這些過量的淋巴細胞不僅包括CD4+T 細胞，而且包括CD8+T 細胞、B 細胞、漿細胞和巨噬細胞。從而出現口干、眼干為主要特征的全身性慢性炎性自身免疫性疾病。其病因、發病機制目前尚不明確，目前普遍認為過度活化的濾泡型輔助性T 淋巴細胞(Follicular helper T lymphocytes，Tfh)是原發性干燥綜合征免疫病理進程中的中心環節。本文就Bcl-6/Blimp-1/IL-21 在PSS 中的發病機制做一初步研究。

1 對象與方法

1.1 實驗組 均來自2012 年3 月至2013 年12 月在河北醫科大學第二醫院免疫風濕科住院治療的原發性干燥綜合征患者55 例，其中15 例行唇腺活檢同時留取標本，符合2002 年PSS 國際分類標準［3］。所有患者均知情同意。其中30 例(繼發腎小管酸中毒患者2 例，血液系統受損患者8 例，周圍神經病變患者2 例，肺間質纖維化患者5 例，無系統損害的患者13 例)接受唇腺活檢，年齡14～78 歲，中位年齡54.5 歲;40 例(其中15 例同意唇腺活檢)留取晨起空腹血清，年齡14～78 歲，中位年齡54 歲。同時選擇我院口腔外科黏液腺囊腫、下唇外傷等非自身免疫性疾病11 例，行唇腺活檢，年齡30～60 歲，中位年齡50.0 歲;30 例體檢部1 周內參加體檢的健康人群，留取外周血，年齡22～56 歲，中位年齡34 歲。

1.2 臨床指標記錄 血常規、尿常規、生化全項、免疫球蛋白IgG、自身抗體、胸部CT、病理檢查。

1.3 主要試劑 Anti-Bcl-6 antibody 購自BD Biosciences，Blimp-1 Antibody 購自EterLife，人白介素21 ELISA 試劑盒(96tests)購自上海巧伊生物技術有限公司，SP 免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.4 ELISA 雙抗體夾心法檢測 于清晨6:00～7:00 之間于肘前靜脈采集pSS 患者新鮮空腹靜脈血標本，1 h 內完成標本離心，轉數選為3 000 r/min，離心時間為10 min。完全分離后的血清迅速分置于若干PC 管內，編號，放置于-80℃冰箱中長期保存;人白介素21 ELISA 試劑盒(96tests)靈敏度可達15 pg/ml，板內、板間變異系數均小于10%。按說明書操作，標準品與待測樣本均作復孔，取平均值。

1.5 免疫組化檢測 將石蠟包埋的組織切成厚度4 μm 切片，脫蠟;3%甲醛-H2O2溶液，避光封閉15 min，PBS 液洗3 次×5 min;抗原修復即將切片完全浸泡在枸櫞酸鹽修復液微波修復 80℃× 5 min，40℃×10 min，待自然冷卻后，PBS 液洗3 次×5 min;正常山羊血清封閉液封閉，37℃冰箱孵育30 min，甩去多余液體;滴加一抗(抗Bcl-6/Blimp-1)于濕盒中4℃過夜，PBS 液洗4 次×10 min;滴加生物素化第二抗體，37℃冰箱孵育30 min，PBS 液洗3 次×5 min;滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃冰箱孵育30 min，PBS 液洗3 次×5 min;二氨基聯苯胺(DAB)顯色，鏡下觀察及時終止顯色。蘇木素復染，脫水，清洗，中性樹膠封片。

1.6 免疫組化結果判定標準 計數5 個高倍鏡視野中的陽性細胞數目(檢測Bcl-6 時，胞核為淡黃色至棕褐色者為陽性標志，檢測Blimp-1 時，胞核為淡黃色至棕褐色者為陽性標志)，并按照陽性細胞數目比例＜1%、1%～25%、26%～50%、51%～75%、＞75%分為5 個等級，計為0 分、1 分、2 分、3 分、4分;據染色強度分為染色強度弱(淡黃色)、中(棕黃色)、強(棕褐色)三個等級，記為1 分、2 分、3 分，陰性不著色，記為0 分;陽性細胞數目比例評分×染色強度評分做為每例標本最后綜合計分，綜合記分≥1為表達陽性，＜1 則為陰性［4］。

1.7 統計學分析 數據的統計學處理采用軟件SPSS13.0，非正態、方差齊性采用秩合檢驗;正態、方差齊性采用t 檢驗。兩等級資料間相關性分析采用spearman 相關系數。統計描述采用中位數(Medican，M)、上四分位(Interquartile up，QU)、下四分位(Interquartile low，QL)、均數加減標準差(±s)。以檢驗水準α=0.05，P＜0.05 為有統計學意義。

2 結果

2.1 唇腺組織形態學改變 光鏡下觀察，正常對照組唇腺組織腺泡大小均勻，導管排列整齊，無擴張，間質無或少量炎性細胞浸潤(見圖1A);疾病組腺泡大小不等，部分腺體萎縮，以導管周圍為明顯，間質有1 個或多個灶性淋巴細胞浸潤(見圖1B)。

2.2 唇腺組織Bcl-6 蛋白的表達 對照組唇腺組織中導管上皮細胞、腺泡上皮細胞的細胞核中未見或極少量Bcl-6 蛋白的表達(見圖2A);疾病組Bcl-6蛋白主要表達于淋巴細胞灶中，分布于部分導管上皮細胞及其周圍淋巴細胞的細胞核上，多數呈棕褐色強陽性反應，極少數呈淡黃色弱陽性反應;少數間質散在浸潤的淋巴細胞亦呈弱陽性反應，腺泡上皮細胞偶爾可檢測到陽性細胞(見圖2B)，二者差異具有統計學意義(見表1);將疾病組按淋巴細胞浸潤情況分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4 個等級(見圖3)，統計學分析4 個等級間Bcl-6 蛋白的表達差異有統計學意義(見表2)，Bcl-6 蛋白的表達與病理分級呈顯著正相關(rs=0.644，P＜0.001)。

2.3 唇腺組織Blimp-1 蛋白的表達 對照組唇腺組織導管上皮細胞、腺泡上皮細胞的細胞核中未見或偶有Blimp-1 蛋白的表達(見圖4A);疾病組Blimp-1 蛋白主要表達在異位生發中心，分布于部分導管上皮細胞的胞核中，偶見分布于腺泡上皮細胞的胞核，多數呈棕褐色陽性反應(見圖4B);二者差異有統計學意義(見表1);將疾病組按淋巴細胞浸潤情況分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4個等級(見圖5)，統計學分析4 個等級間差異有統計學意義(見表2)，Blimp-1 蛋白的表達與病理分級呈正相關(rs=0.637，P＜0.001)。

2.4 Bcl-6/Blimp-1 在不同臟器損害的PSS 患者唇腺組織中的表達 腎小管酸中毒、血液系統受累、周圍神經病變、肺間質纖維化及無系統損害五組間Bcl-6/Blimp-1 蛋白表達，差異無統計學意義(見表3)。

圖1 疾病組與對照組唇腺組織病理活檢(HE，×400)Fig.1 Pathological biopsy of labial salivary glands(LSG)tissues in disease and control group(HE，×400)

圖2 兩組唇腺組織中Bcl-6 蛋白的表達(IHC，×400)Fig.2 Expression of Bcl-6 in LSG tissues of two groups(IHC，× 400)

圖3 四個病理等級中Bcl-6 的表達(IHC，×400)Fig.3 Bcl-6 expression of four pathological grades(IHC，×400)

表1 疾病組與對照組Bcl-6/Blimp-1 的比較Tab.1 Comparison of Bcl-6，Blimp-1 protein between disease group and control group

圖4 兩組唇腺組織中Blimp-1 蛋白的表達(IHC，×400)Fig.4 Expression of Blimp-1 in LSG tissues of two groups(IHC，× 400)

圖5 四個病理等級中Blimp-1 的表達(IHC，×400)Fig.5 Blimp-1 expression of four pathological grades(IHC，×400)

表2 Bcl-6/Blimp-1 在疾病組不同病理級別中的表達Tab.2 Bcl-6/Blimp-1 expression in different pathological grades

表3 Bcl-6/Blimp-1 在不同臟器損害的疾病組唇腺組織中的表達Tab.3 Comparison of Bcl-6/Blimp-1 protein levels among system involvement of disease groups

表4 IgG 升高組與正常組Bcl-6/Blimp-1 表達水平Tab.4 Comparison of Bcl-6/Blimp-1 level between IgG rise group and normal group

表5 疾病組與對照組血清IL-21 的表達水平(±s)Tab.5 Serum IL-21 levels of two groups(±s)

表5 疾病組與對照組血清IL-21 的表達水平(±s)Tab.5 Serum IL-21 levels of two groups(±s)

Note:Inspection level，α=0.05.

表6 IL-21 在疾病組不同病理級別中表達水平的比較Tab.6 IL-21 expression level in different pathological grades

圖6 Bcl-6 與Blimp-1、Bcl-6 與IL-21、IL-21 與IgG 之間的線性關系Fig.6 Correlation between Bcl-6 and Blimp-1，serum levels of IL-21;correlation between serum levels of IL-21 and IgG

2.5 Bcl-6/Blimp-1 與免疫學指標的關系 免疫球蛋白(IgG)升高組、正常組Bcl-6/Blimp-1 蛋白表達，差異無統計學意義(見表4)。

2.6 疾病組與對照組血清IL-21 表達水平的比較兩組血清IL-21 表達水平比較經統計學分析具有統計學意義，疾病組高于對照組，見表5。

2.7 疾病組血清IL-21 的表達與唇腺組織病理等級的關系 唇腺活檢HE 染色淋巴細胞浸潤情況分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4 個病理等級，4 個病理等級中IL-21 表達水平具有統計學意義(見表6)。相關性分析，疾病組IL-21 表達水平與唇腺活檢病理等級呈正相關，(rs=0.769，P=0.001)。

2.8 Bcl-6/Blimp-1、IL-21/IgG、Bcl-6/IL-21 之間的線性關系 30 例行唇腺活檢PSS 唇腺組織中Bcl-6與Blimp-1 的表達成正相關(rs=0.566，P=0.001);留取靜脈血的40 例PSS 血清IL-21 的表達水平與IgG 表達水平呈正相關(rs=0.871，P＜0.01);15 例唇腺活檢同時留取靜脈血的PSS 唇腺組織Bcl-6 的表達與血清IL-21 的表達呈正相關(rs=0.652，P=0.008)。見圖6。

3 討論

干燥綜合征是彌漫性結締組織病中的一種，以侵犯淚腺、唾液腺等外分泌腺體，具有高度淋巴細胞浸潤為主要特征。病理上主要表現為外分泌腺體間質大量淋巴細胞浸潤形成生發中心(其內大多數為CD4+T 細胞、也有CD8+T 細胞、B 細胞、漿細胞以及巨噬細胞)，其中CD4+T 細胞主要為濾泡型輔助性T 淋巴細胞(Follicular helper T lymphocytes，Tfh)，最近證實Tfh 細胞是生發中心B 細胞分化和生存的重要信號［5］。

Bcl-6 是Tfh 細胞的轉錄因子，表達于生發中心CD4+T 細胞、B 細胞的細胞核中，促進Tfh 細胞增殖、分化，進一步促進Tfh 細胞表達細胞因子如IL-21，趨化因子CXCR5，共刺激分子ICOS，進而與B細胞相互作用，在CXCL13 的趨化作用下，歸巢，最終在唇腺組織中形成淋巴細胞灶，導致腺泡萎縮，導管擴張或狹窄，纖維組織形成。Davis 研究小組于1994 年在實驗中發現Blimp-1 是由prdm1(positive regulatory domain zinc finger protein 1)基因表達，在成熟B 細胞終極分化為記憶性B 細胞、漿細胞的過程中起關鍵的作用［6］，其最顯著的特點是促使成熟B 細胞發育為能夠分泌抗體的具有漿細胞表型的B細胞。研究發現，CD4+T 細胞中的非Tfh 細胞的細胞核中高表達Blimp-1，與Tfh 細胞的轉錄因子Bcl-6具有相互拮抗的作用，同時B 細胞中Blimp-1 做為Bcl-6 的拮抗劑可抑制Tfh 細胞分化，反之，Bcl-6 也抑制Blimp-1 表達，促進Tfh 細胞分化［7］。Tfh 細胞數量和功能的異常使自身免疫失衡，對誘發自身免疫性疾病具有重要作用。原發性干燥綜合征與類風濕關節炎、系統性紅斑狼瘡都屬于常見的自身免疫性疾病，雖然它們的病因和發病機制尚不明確，但都與體內的免疫失衡、免疫破壞有關。本課題前期研究顯示［13］，在pSS 患者的唇腺組織中，可見大量CXCR5 及IL-21 陽性細胞浸潤，提示Tfh 細胞在SS中具有致病作用。本課題研究發現唇腺組織中，疾病組Bcl-6/Blimp-1 蛋白的表達水平明顯高于對照組;疾病組血清IL-21 的表達水平亦明顯高于對照組。疾病組唇腺組織Bcl-6 蛋白的表達與唇腺組織Blimp-1 蛋白的表達水平成正相關、與血清IL-21 的表達亦成正相關;疾病組血清IL-21 的表達水平與IgG 水平高低成正相關。Bcl-6/IL-21 在原發性干燥綜合征發病機制中的作用:①Bcl-6 的過表達在體內和體外實驗中均能導致Tfh 細胞中CXCR5、CXCR4、PD-1、ICOS、IL-21R 和IL-6R 等標記物的上調及CCR7 的下調，并驅動Tfh 細胞的分化［8-10］。②Ettinger 等［11］指出，IL-21 的重要作用之一是促進B細胞的活化，并在體液免疫應答過程中調控B 細胞的分化或凋亡，血清IL-21 水平的增高是大多自身免疫疾病患者的病理性特征表現。在自身免疫病的致病過程中，由于IL-21 對體液免疫的關鍵性促進作用，機體產生了過量的致病性自身抗體，因此如何以阻斷IL-21 的形成為靶點對自身免疫病進行干預治療，成為新近的研究焦點。

根據Chisholm 唇腺病理分級標準，疾病組按淋巴細胞浸潤程度，將唇腺組織分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4個等級，實驗結果顯示，隨著浸潤淋巴細胞數的增多，Bcl-6/Blimp-1/IL-21 的表達均為增高趨勢，說明在唇腺組織中存在大量的Tfh 細胞，而且Tfh 細胞處于活化狀態，并與唾液腺受累嚴重程度密切相關。本實驗中，在某些疾病組病例中，雖未達到病理分級診斷標準，但其實驗室指標、臨床指標均支持，說明Tfh 細胞在PSS 患者早期既存在，進一步說明Tfh 細胞的表達，在誘發及維持生發中心的形成中發揮著重要作用，因此需在下一步的治療中密切隨訪、觀察患者的臨床癥狀及病理變化。將疾病組按系統損壞分組，經統計學分析顯示Bcl-6/Blimp-1/IL-21 的表達水平無統計學差異，因分組后各組樣本含量較少，各組間樣本量分布不均勻，尚不能說明Bcl-6/Blimp-1/IL-21 參與了Pss 系統損害的發病機制，所以此統計結果的臨床價值有待于進一步收集樣本、實驗、探討和研究。免疫球蛋白IgG 與Bcl-6/Blimp-1 蛋白的表達水平作統計學研究發現，升高組與正常組間并無統計學差異。原因可能為:①體液免疫反應是復雜免疫過程，漿細胞分化受眾多T、B 淋巴細胞刺激，在PSS 患者發病過程中，除Tfh 細胞對B細胞、漿細胞發揮調節作用外，可能還受輔助性T細胞(T help cell，Th)17 等其他T 細胞亞群的影響，下一步可進行其他T 細胞亞群在pSS 患者致病作用的研究;②研究對象樣本含量少，故增大實驗誤差;③由于標本取得的可行性限制，所選研究對象并不都具備代表性的抗體陽性;但免疫球蛋白IgG 與血清IL-21 的表達水平作統計學研究發現，升高組與正常組組間差異有統計學差異，提示外周循環中高水平的IL-21 與pSS 患者體內免疫球蛋白類別轉換存在一定聯系［12］，間接體現了IL-21 是pSS 發病時重要的促B 細胞效應因子，可調控B 細胞活化增殖，并調節免疫球蛋白的產生與Ig 的類型，推測血清IL-21 水平異常升高的pSS 患者發生高球蛋白血癥時，Ig 的類型更傾向于以IgG 為主的單克隆性球蛋白，一定程度上加重了pSS 的病情活動。

綜上所述，pSS 患者唇腺組織生發中心Bcl-6/Blimp-1 蛋白的表達增高、血清IL-21 表達水平增高，且與唇腺組織中淋巴細胞的浸潤程度有關，提示Bcl-6/Blimp-1/IL-21 可能參與了原發性干燥綜合征的發病機制，換言之，Tfh 細胞在pSS 患者唾液腺功能損傷中發揮重要作用。通過本實驗的研究希望能為原發性干燥綜合征病人的治療提供新的思路，研制出新的生物治療藥物。

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