AIM2 炎癥小體在感受細(xì)胞漿DNA 中的作用①

宋啟斌 褚玉新 胡偉國(guó) (武漢大學(xué)人民醫(yī)院腫瘤中心，武漢 430060)

天然免疫系統(tǒng)中存在一些模式識(shí)別受體(Pattern recognition receptors，PRR)［1］，能夠識(shí)別病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecular pattern，PAMP)，如脂多糖、膚聚糖或病毒RNA，以及危險(xiǎn)相關(guān)分子模式(Danger-associated molecular pattern，DAMP)，如DNA、RNA 或尿酸，這些物質(zhì)異常出現(xiàn)在細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)的某個(gè)部位，隨后激活天然免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生炎癥因子以抵御外源性或內(nèi)源性因素對(duì)機(jī)體的損害;同時(shí)作為預(yù)警信號(hào)，向抗原提呈細(xì)胞發(fā)出警報(bào)，從而啟動(dòng)獲得性免疫應(yīng)答，是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁［2］。AIM2 是近些年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種PRR，能夠感受DNA 病毒或細(xì)菌感染時(shí)釋放到細(xì)胞漿的dsDNA，經(jīng)ASC 活化Caspase-1，促進(jìn)IL-1β 和IL-18 成熟釋放，或誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡。也有報(bào)道稱AIM2 炎癥小體在某些自身免疫病中發(fā)揮重要作用。本文將介紹AIM2 炎癥小體在天然免疫系統(tǒng)防御病毒入侵、F.tularensis 感染以及自身免疫病中發(fā)揮的作用，論述這些dsDNA 活化AIM2 的過程。

1 細(xì)胞漿內(nèi)DNA 感受器簡(jiǎn)介

在過去的幾十年中，盡管人們對(duì)細(xì)胞外PAMP信號(hào)通路的認(rèn)識(shí)有了很大進(jìn)展，但是，細(xì)胞漿內(nèi)DNA 識(shí)別感受器直到最近才被發(fā)現(xiàn)，這些DNA 感受器包括TLR9(Toll-like receptor 9)，DAI(DNA-dependent activator of IFN regulatory factors)，Pol Ⅲ(DNA-dependent RNA polymerase III)，LRRFIP1(Leucine-rich repeat in Flightless Ⅰ interacting protein-1)，IFI16，Ku70，AIM2 等［3］。dsDNA 不僅能夠通過上述感受器活化NF-kB 和I 型干擾素通路，還能活化單核-巨噬細(xì)胞中的caspase-1 通路［4］。

2 AIM2 炎癥小體

炎性小體是細(xì)胞感受內(nèi)源性或外源性危險(xiǎn)信號(hào)刺激后，與ASC 和Caspase-1 前體(pro-caspase-I)形成的一種多蛋白復(fù)合體，從而導(dǎo)致Caspase-I 前體的裂解而活化，活化的Caspase-1 裂解pro-IL-1β 和pro-IL-18，引起IL-1β 和IL-18 的成熟和釋放以及pyroptosis 形式的細(xì)胞死亡［5］，可以在巨噬細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞的胞漿中形成［6］。

AIM2 是目前已知的唯一可識(shí)別細(xì)胞漿DNA 的炎性小體。AIM2 是HIN-200 家族的成員。人AIM2基因定位于1q22，cDNA 全長(zhǎng)1 485 bp［7］。AIM2 蛋白由344 個(gè)氨基酸分子構(gòu)成，蛋白分子量大小約為3 9487 Da［7］。AIM2 擁有HIN-200 蛋白家族的兩個(gè)典型結(jié)構(gòu)域(圖1)，即N-末端的PYD 結(jié)構(gòu)域(Pyrin domain)和C-末端的OB 結(jié)構(gòu)域(Oligonucleotide/oligosaccharide-binding domain，OB)。PYD 進(jìn)化上高度保守，在募集ASC 的過程中均發(fā)揮重要作用［8］。AIM2 的C 末端兩個(gè)相鄰的OB 結(jié)構(gòu)域與核酸識(shí)別相關(guān)，具有這種結(jié)構(gòu)特征的蛋白參與DNA 復(fù)制、重組、修復(fù)及端粒保持等過程［9］。就AIM2 炎癥小體而言，AIM2 蛋白就是啟動(dòng)成分，通過其HIN200 結(jié)構(gòu)域識(shí)別并結(jié)合細(xì)胞漿DNA［10］，而ASC 蛋白可以銜接上游AIM2 和下游pro-caspase-1 活化成分［11］。

3 AIM2 炎癥小體是細(xì)胞質(zhì)雙鏈DNA 的感受器

Fernandes-Alnemri 等［12］指出，胞質(zhì)內(nèi)的DNA受體應(yīng)該具有以下兩個(gè)特征:一是能夠結(jié)合并識(shí)別DNA;二是能夠被細(xì)胞因子正反饋調(diào)控以保證免疫應(yīng)答的強(qiáng)度。利用confocol 技術(shù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AIM2 是定位于細(xì)胞質(zhì)且符合以上兩點(diǎn)的唯一蛋白。因此，后續(xù)的研究以AIM2 作為對(duì)象，利用免疫沉淀結(jié)合核酸親和純化的方法，發(fā)現(xiàn)AIM2 能夠在體外和DNA 直接結(jié)合，其HIN 結(jié)構(gòu)域的165 位氨基酸對(duì)于其DNA 識(shí)別是至關(guān)重要的。這滿足了AIM2 作為胞質(zhì)DNA 識(shí)別受體的先決條件。利用免疫共沉淀和confocol 技術(shù)也發(fā)現(xiàn)AIM2 能夠和炎性復(fù)合體的關(guān)鍵接頭蛋白ASC 相互結(jié)合，兩者呈現(xiàn)共定位。接下來(lái)，作者在THP1 細(xì)胞中研究AIM2 是否參與DNA 的識(shí)別，發(fā)現(xiàn)THP1 細(xì)胞被PMA 誘導(dǎo)分化的過程中，AIM2 的mRNA 水平明顯上調(diào)，這提示AIM2 參與DNA 的識(shí)別。利用siRNA 干擾AIM2 的表達(dá)后，能夠明顯抑制DNA 誘導(dǎo)的IL-1β 的釋放，這說(shuō)明AIM2 對(duì)于DNA 介導(dǎo)IL-1β 的釋放是必需的。最后，作者在HEK-293 細(xì)胞中重構(gòu)AIM2 炎性復(fù)合體，發(fā)現(xiàn)AIM2 確實(shí)能夠作為炎性復(fù)合體的重要部分參與介導(dǎo)IL-1β 的釋放。AIM2 氨基端Pyrin結(jié)構(gòu)域的14 位氨基酸對(duì)于其結(jié)合ASC 并最終促進(jìn)caspase-1 活化、IL-1β 釋放是至關(guān)重要的。該研究最終證明了，AIM2 炎性復(fù)合體識(shí)別胞質(zhì)DNA，從而引起炎性因子釋放，啟動(dòng)固有免疫應(yīng)答。

激光共聚焦顯微鏡下可見細(xì)胞漿DNA 與AIM2的HIN200 結(jié)構(gòu)域相互作用，形成寡聚體［12］。完整組裝的寡聚AIM2/DNA 復(fù)合物進(jìn)一步通過PYDPYD 交互來(lái)募集ASC，導(dǎo)致ASC 寡聚化［13］.然后，ASC 通過CARD 結(jié)構(gòu)域募集pro-caspase-1，通過誘導(dǎo)接近機(jī)制導(dǎo)致caspase-1 活化。活化的caspase-1催化產(chǎn)生成熟的IL-1β 和IL-18，或?qū)е录?xì)胞焦亡［12，13］。圖2 展示了AIM2 小體各組成成分以及活化機(jī)制。

Hornung 等［14］用基因敲除和基因沉默AIM2后，發(fā)現(xiàn)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生明顯減少，這表明AIM2 對(duì)于炎癥因子的產(chǎn)生或釋放發(fā)揮重要作用。Leonie 等［15］的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞漿dsDNA 可被干擾素誘導(dǎo)蛋白AIM2 活化。AIM2 通過其HIN200 結(jié)構(gòu)域與dsDNA 結(jié)合，進(jìn)一步組裝成一個(gè)大的炎癥小體復(fù)合物，從而防御DNA 病毒(如小鼠巨細(xì)胞病毒，牛痘病毒)，Listeria 菌和Francisella 菌的感染。在下文的論述中，我們將著重介紹AIM2 炎癥小體在天然免疫應(yīng)答中識(shí)別微生物和非微生物DNA 刺激時(shí)所發(fā)揮的作用，以及誘發(fā)炎癥反應(yīng)的機(jī)制。

圖1 AIM2 的結(jié)構(gòu)模式圖Fig.1 Ideograph of AIM2 structure

4 AIM2 炎癥小體在感受胞漿病毒DNA 中發(fā)揮的作用

牛痘病毒是已知的最大的DNA 病毒，能夠在受感染細(xì)胞的胞漿中完整復(fù)制DNA，然后被AIM2 識(shí)別，活化下游的炎癥小體通路。然而，AIM2 缺陷的巨噬細(xì)胞在感染牛痘病毒時(shí)不能活化caspase-1［16］。然而，如果感染時(shí)間大于24 h，也會(huì)有少量caspase-1被牛痘病毒活化，可能是活化了NLRP3 炎癥小體。以上研究結(jié)果說(shuō)明牛痘病毒引發(fā)的炎癥反應(yīng)主要依賴于AIM2，但是也可能在AIM2 缺陷時(shí)活化其他炎癥小體來(lái)誘導(dǎo)相對(duì)較弱的前炎癥反應(yīng)。

Roberts 等［10］發(fā)表在science 上的報(bào)道稱巨噬細(xì)胞胞漿中表達(dá)的AIM2 能夠識(shí)別病毒dsDNA，并且能夠與dsDNA 結(jié)合后誘導(dǎo)IFN-β 的產(chǎn)生，活化形成炎性體，啟動(dòng)天然免疫應(yīng)答。為了驗(yàn)證作為dsDNA 代表的巨細(xì)胞病毒(CMV)在感染早期被AIM2 識(shí)別并激活免疫應(yīng)答，國(guó)內(nèi)李旭芳等［17］由小鼠脾組織中提取CMV 感染的巨噬細(xì)胞，富集各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的模擬感染鼠和MCMV 感染鼠的多個(gè)脾組織中的巨噬細(xì)胞，并經(jīng)過3～4 次的重復(fù)各組試驗(yàn)。Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示MCMV 感染小鼠脾臟巨噬細(xì)胞后AIM2，ASC，caspase-1 蛋白表達(dá)呈現(xiàn)一致的變化，即在感染早期(感染后第3 天)均明顯升高并達(dá)峰值，并進(jìn)一步證實(shí)AIM2 炎性體通路在MCMV 感染的巨噬細(xì)胞中的表達(dá)增加;同時(shí)，通路下游細(xì)胞因子IL-1β 和IL-18 的成熟釋放也明顯增加，積極參與炎癥反應(yīng)并進(jìn)一步活化獲得性免疫應(yīng)答。

圖2 AIM2 炎癥小體模式圖Fig.2 Ideograph of AIM2 inflammasome

Vijay 等［18］發(fā)現(xiàn)AIM2 缺陷小鼠的巨噬細(xì)胞接種MCMV 后血清IL-18 明顯減少，病毒滴度明顯升高，死亡率增加。這些證據(jù)均顯示巨噬細(xì)胞能夠通過AIM2 炎癥小體早期識(shí)別胞漿MCMV DNA，并可能成為CMV 感染及感染后引起的其他疾病的治療靶點(diǎn)。

2013 年Wu 等［19］研究發(fā)現(xiàn)乙肝病毒入侵機(jī)體后，能夠使外周血單個(gè)核細(xì)胞中AIM2 表達(dá)水平升高，刺激天然免疫系統(tǒng)分泌IL-1β 和IL-18。尤其是急性乙肝患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞中AIM2 表達(dá)量升高很明顯，而慢性乙肝中，AIM2 表達(dá)量下降，因此，該研究推測(cè)AIM2 表達(dá)與宿主免疫系統(tǒng)對(duì)HBV的清除密切相關(guān)此外，AIM2 也很可能識(shí)別其他的DNA 病毒感染，如HSV-1 或逆轉(zhuǎn)錄病毒。由于AIM2 炎癥小體活化不僅導(dǎo)致炎癥因子的釋放，也會(huì)殺死并清除受感染細(xì)胞，我們可以推測(cè)AIM2 很可能在清除病毒感染中發(fā)揮關(guān)鍵作用，這有助于提高感染DNA 病毒的動(dòng)物存活率。

5 AIM2 炎癥小體對(duì)弗朗西斯菌感染的免疫應(yīng)答

弗朗西斯菌(F.tularensis)是一種革蘭陰性菌，也是一種高度易感的胞內(nèi)寄生菌，能夠感染人、小鼠和兔子等哺乳動(dòng)物，致死率很高。弗朗西斯菌感染細(xì)胞后能引起IL-lβ 和I 型干擾素的分泌增加以及細(xì)胞死亡。美國(guó)Teresa 等［16］研究發(fā)現(xiàn)，小鼠巨噬細(xì)胞的AIM2 分子可以通過識(shí)別弗朗西斯菌的DNA來(lái)活化炎癥小體和caspase-1，進(jìn)而引起促炎性細(xì)胞因子IL-1β 和IL-18 的剪切釋放以及細(xì)胞的死亡。

F.tularensis 主要感染巨噬細(xì)胞并在胞內(nèi)復(fù)制，這樣就可以逃避免疫系統(tǒng)的早期識(shí)別。F.tularensis通過內(nèi)吞作用進(jìn)入巨噬細(xì)胞，進(jìn)入細(xì)胞漿后4～24 h內(nèi)快速?gòu)?fù)制［20］。然后很快讓內(nèi)體裂解，逃離吞噬體時(shí)釋放了大量DNA，被細(xì)胞漿內(nèi)AIM2 識(shí)別并結(jié)合，活化caspase-1，刺激I 型干擾素的產(chǎn)生。相比之下，AIM2 缺陷的小鼠來(lái)源的巨噬細(xì)胞感染F.tularensis后，無(wú)法誘導(dǎo)caspase-1 活化和細(xì)胞死亡［16］。對(duì)AIM2 缺陷的小鼠皮下注射亞致死劑量的F.tularensis 后，72h 內(nèi)所有小鼠都死亡，而相比之下，對(duì)照組AIM2 野生型的小鼠僅有33%死亡［16］。通過AIM2/ASC/caspase-1 炎癥小體誘導(dǎo)細(xì)胞死亡能夠防止感染擴(kuò)散到重要器官，減少細(xì)菌負(fù)荷，使適應(yīng)性免疫有足夠的時(shí)間來(lái)清除細(xì)菌。這一工作證明了AIM2 炎癥小體在天然免疫系統(tǒng)防御F.tularensis感染中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

6 AIM2 炎癥小體在SLE 中發(fā)揮作用

2013 年張文娟等［21］研究SLE 中淋巴細(xì)胞來(lái)源的凋亡DNA(apopDNA)對(duì)巨噬細(xì)胞中AIM2 炎癥小體的影響。發(fā)現(xiàn)AIM2 的表達(dá)與SLE 的病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)。在apopDNA 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中，AIM2 的表達(dá)水平顯著升高，而且與巨噬細(xì)胞的活化密切相關(guān)。用siRNA 沉默AIM2 之后，apopDNA 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化的能力顯著減弱。而且，阻斷AIM2的表達(dá)也會(huì)阻礙巨噬細(xì)胞的活化，抑制apopDNA 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，從而減輕SLE 的癥狀。由此得出結(jié)論，AIM2 是SLE 中一種重要的DNA 感受器，可以作為apopDNA 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化的一種標(biāo)志物。

綜上所述，本文主要探討了天然免疫中細(xì)胞漿DNA，包括細(xì)菌，病毒，以及自身免疫病產(chǎn)生的DNA引起的AIM2 炎癥小體活化和細(xì)胞死亡通路。在這些信號(hào)通路中，干擾素誘導(dǎo)的AIM2 蛋白占主導(dǎo)地位。對(duì)AIM2 缺陷的小鼠和巨噬細(xì)胞的研究證實(shí)了AIM2 炎癥小體能夠感受細(xì)胞漿DNA 的刺激。AIM2 特異性地感受牛痘病毒和細(xì)胞內(nèi)F.tularensis菌釋放到細(xì)胞漿的DNA。AIM2 炎癥小體能夠監(jiān)視DNA 損傷并盡早做出反應(yīng)，不僅能夠分泌IL-1β 和IL-18，也能誘導(dǎo)caspase-1 依賴的細(xì)胞焦亡來(lái)破壞受感染的巨噬細(xì)胞，從而限制感染的擴(kuò)散。某些自身免疫病，如SLE，免疫系統(tǒng)對(duì)自身核酸的應(yīng)答中，AIM2 炎癥小體發(fā)揮重要作用。

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