黃曲霉毒素M1 免疫學檢測方法研究進展①

陳 曦 侯玉澤 蔡齊超 胡驍飛 鄧瑞廣 (河南科技大學食品與生物工程學院，洛陽 471003)

黃曲霉毒素M1(Aflatoxin M1，AFM1)是黃曲霉毒素的一種，是在動物攝入含有黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)的飼料后，AFB1 在體內經羥基化所形成的代謝物。AFM1 主要存在于動物的乳汁中，在肝腎、肉、蛋以及尿液也有存在。隨著人們生活水平的提高，乳及乳制品以其較高的營養價值深受消費者的喜愛。近年來，由于“蒙牛問題奶”、“光明奶粉碘超標”等食品安全事件的發生，AFM1 的污染問題引起了社會的廣泛關注［1］。目前，黃曲霉毒素M1 快速靈敏的免疫學檢測方法已成為國內外學者研究的熱點。

1 黃曲霉毒素M1 概述

AFM1 屬于黃曲霉毒素的一種，其基本結構為一個二呋喃環的氧雜萘鄰酮，熔點299 ℃，形狀為長方形片狀，無色結晶，且可溶于多種有機溶劑，如氯仿、乙腈和甲醇等［2，3］。黃曲霉毒素M1 在365 nm的紫外線下可發出藍紫色的熒光［4］。

黃曲霉毒素是目前發現的強致癌物之一，它的毒性高于氰化物、砷化物和有機農藥的毒性，是氰化鉀的5 倍，砒霜的40 倍［5-7］。哺乳動物攝入被AFB1污染的食品或飼料之后，在體內肝微粒體單氧化酶的催化下，通過細胞色素P450 的調節作用，末端呋喃環C-10 被羥基化就生成了AFM1［9］。研究發現，人類和乳牛攝入AFB1 后，在其乳汁中變成AFM1的轉化率為0.3%～6.1%［10］。AFM1 毒性主要表現在致癌性和致突變性，對人及動物肝臟組織有破壞作用，嚴重時，可導致肝癌甚至死亡。陳振元［11］、鄔少明［12］、涂文升［13］等研究人員通過對啟東、扶綏等肝癌高發區的研究，發現肝癌的發病率與AFB1的攝入以及轉化為AFM1 的轉化率有密切關系。

近年來，AFM1 在乳及乳制品中的污染現象十分普遍。Rahimi 等［14］調查了150 份伊朗農場的乳樣，其中包括60 份牛乳，42 份綿羊乳和48 份山羊乳。在分析的樣品中，黃曲霉毒素M1 檢出的概率是46.7%，平均濃度是(40.35±22.2)ng/L。在受污染的樣品中，有37.5%的牛乳和5.9%的山羊乳中黃曲霉毒素M1 的含量高于50 ng/L。Zinedine等［15］用免疫親和柱-熒光色譜法檢測來自摩洛哥五個不同的生產乳制品的公司的54 個樣品中的黃曲霉毒素M1 的含量。分析結果表明，在摩洛哥的受檢樣品中，88.8%的受檢樣本都受到了AFM1 污染，僅7.4%的受檢樣本低于0.05 μg/L。Dutton 等［16］分別對南非的九家奶牛場的生乳及成品牛乳進行了抽樣，結果所有生乳均檢出了黃曲霉毒素M1，絕大部分的成品牛乳中黃曲霉毒素M1 的含量超過0.05 μg/L。針對食品中AFM1 的污染問題及其強烈的毒性作用，部分國家和地區都制定了乳制品中AFM1 的限量標準(表1)，其中歐盟和日本對乳制品中AFM1 的限量標準要求最為嚴格。

表1 部分國家和地區AFM1 的限量標準Tab.1 Permissible limit of AFM1 in some countries and regions

為避免食品中AFM1 的污染對人體健康造成危害，針對食品中AFM1 的定性定量檢測方法就顯得尤為重要。傳統檢測方法有薄層層析色譜法(TLC)和高效液相色譜法(HPLC)。但是由于TLC 只能定性不能定量，而且所需時間長;HPLC 樣品處理過程較為繁瑣，儀器昂貴。所以，這兩種方法在實際應用中都無法進行大范圍推廣。基于抗原抗體反應的免疫學檢測方法具有靈敏性好、特異性強、操作簡單等優點，可以進行現場大規模檢測，能夠得到很好的推廣。近年來，隨著學科間的相互滲透，免疫學檢測方法涉及的范圍不斷擴大，新的免疫學檢測方法層出不窮。

2 酶聯免疫吸附(ELISA)法

自1971 年Engvall［19］將ELISA 用于IgG 定量測定，使得酶標抗體技術逐步發展成液體標本中微量物質的測定方法。酶聯免疫吸附法的原理是將抗體或完全抗原包被在固相載體上，測定時將待測樣品和酶標抗原或抗體的混合物與固相載體表面吸附的抗體或抗原反應，再洗滌去除抗原抗體復合物或游離成分，然后加入酶作用底物，催化顯色，最后加終止液終止反應［20，21］。ELISA 方法具有快速簡便、特異性高、敏感性強、無需昂貴的儀器設備且對樣品的純度要求不高等優點，特別適應于大批樣品的檢測，在AFM1 的快速檢測上有較高的應用價值。由于該方法對樣品純度要求不高，所以在試驗中易產生假陽性現象，且受外在環境影響較大。

裴世春等［22］采用牛血清白蛋白與AFM1 偶聯，制備人工抗原免疫BALB/c 小鼠，獲得了特具有靈敏性高、特異性強的單克隆抗體，并利用此抗體建立間接競爭定量ELISA 方法，該方法的最低檢出限是0.08 ng/ml，校正曲線的線性范圍為0.04～5 ng/ml。Laura 等［23］發現了一種可半定量測定AFM1 的側流裝置，具有較高的靈敏度，最低檢測限量為20 ng/L。Zhang 等［24］利用兩步篩選法篩選出5 株具有抗黃曲霉毒素且親和力高的通用細胞株，其中ICII細胞株親和力最好，靈敏度最高，對AFM1 的最低檢出限為13.2 pg/ml。Guan 等［25］利用半固體篩選法，篩選出抗AFM1 的細胞株，該細胞株的親和力達到1.74×109L/mol 且與黃曲霉毒素B1、B2、G1 和G2 都無交叉反應，利用此抗體建立了超靈敏的間接競爭酶聯免疫吸附法，可檢測牛奶及嬰幼兒乳制品，檢測限分別為3 和6 ng/L，將該方法應用于樣品中檢測，回收率在91%～110% 之間，變異系數小于10%，與標準的HPLC 比較，具有非常好的相關性。

3 電化學免疫傳感器法

電化學免疫傳感器是將高靈敏的傳感技術與特異性免疫反應結合起來，用以監測抗原抗體反應的生物傳感器，具有快速、靈敏、選擇性高、操作簡便等特點，已廣泛地應用在臨床各個領域［26］。電化學免疫傳感器主要有競爭和非競爭兩種模式來檢測黃曲霉毒素。

競爭模式是將特異性的抗體或抗原-蛋白復合物固定在探針上。在競爭反應中，游離的酶-目標物復合物與目標物競爭結合探針上的抗體或抗原。最后根據酶催化氧化底物所產生電流的多少進行定量。Micheli 等［27］研制出AFM1 的檢測探針，并對pH 值、每一個步驟的時間、溫度的長度等參數進行了優化，得出AFM1 的最低檢測限為25ppt。并與色譜法進行比較，得出電化學法具有更好的檢測限和更短的分析時間。

非競爭模式是通過抗體—抗原復合物一步式免疫反應實現。抗原與抗體一酶復合物的結合，對電子探針產生阻礙導致電流發生變化。Parker 等［28］采用這種方法，測定牛奶中AFM1 的含量，得出的AFM1的檢測范圍為39～1 000 ng/L。與高效液相檢測方法相比，靈敏度上是可以相媲美的，在便攜性和成本上卻是大大優于后者。Dinckaya 等［29］創建了一個檢測黃曲霉毒素M1 的新的免疫傳感器，以金納米粒子為金電極，搭配半胱胺的單層膜，再加上探測器，組裝成新的免疫傳感器。該傳感器檢測黃曲霉毒素M1的范圍為1～14 ng/ml，偏差為0.36 ng/ml。

4 免疫熒光法

免疫熒光技術就是將已知的抗原或抗體標記上熒光素或有熒光的物質制成熒光標記物，再用這種熒光抗體(或抗原)作為分子探針檢查細胞或組織內的相應抗原(或抗體)。然后用熒光顯微鏡進行觀察，從而確定抗原或抗體的性質、定位，以及利用定量技術測定含量［30］。該方法具有特異性強、靈敏度高、標準曲線范圍寬、分析速度快、標記物制備較簡便、有效使用期長、無放射性污染等優點。該方法一般與免疫層析配合使用，但是樣品處理完全依賴免疫親和柱，樣品的提取液未經色譜柱分離，遇到復雜的基質樣品或共存干擾物，可能會帶來結果偏差。

王偉等［31］用熒光光度法測定高乳脂乳和乳制品中的黃曲霉毒素M1，該方法的檢測限為0.1 μg/kg，相對標準偏差低于5%，回收率88%～93%。已經能夠滿足對進出口乳及乳制品中黃曲霉毒素M1的檢測。Beloglazova 等［32］用熒光標記技術定量測定牛奶中黃曲霉毒素M1，得到的最低檢測限是0.014 μg/kg。而且假陽性和假陰性結果的比率分別為2.6%和3.3%，均低于5%。

5 膠體金免疫層析法

膠體金免疫層析技術就是利用膠體金本身的顯色特點結合免疫層析技術診斷特異性的待測物而發展起來的［33］。它在對樣品的檢測過程中，既不需要對樣品進行分離純化，也不需對樣品檢測溶劑做任何的前處理，方便、快捷。該技術現已廣泛應用于研制各種膠體金免疫層析試紙條和試劑盒。但是，膠體金免疫層析試紙條和試劑盒一般保存時間有限，在常溫下不能長久保存。

Wang 等［34］研制出一種用于檢測乳及乳制品中AFM1 的納米金免疫層析試紙條。在檢測的15 種乳及乳制品中，有6 種乳及乳制品存在輕微的AFM1 污染，所有乳及乳制品中AFM1 均低于1 ng/ml。該試紙條的檢測限為0.028 ng/ml，檢測時間為10 min。孫翠萍等［35］利用膠體金免疫層析技術研制了一種快速檢測牛奶中的AFM1 試紙條，經過測試，該試紙條的檢測限為0.5 ng/ml，檢測時間為10 min，假陽性率和假陰性率均為0，該方法準確，可靠，使用簡便，適合大量樣品的現場檢測。

6 無毒檢測法

在AFM1 檢測過程中，必不可少的要使用到AFM1 標準品，而AFM1 毒性較強，很可能對實驗人員以及環境造成危害，但是，噬菌體展示技術的出現可能為我們打開了另一扇門。噬菌體展示技術是將外源蛋白或多肽的DNA 序列插入到噬菌體外殼蛋白結構基因的適當位置，使外源基因隨外殼蛋白的表達而表達，同時，外源蛋白隨噬菌體的重新組裝而展示到噬菌體表面的生物技術［36］。熊嘯等［37］以抗AFM1 的單克隆抗體為篩選配基，經過淘選，從噬菌體隨機七肽庫中篩選獲得了與抗AFM1 單克隆抗體具有較高親和性的陽性噬菌體克隆。也即是說，模擬的表位肽能夠取代AFM1 進行反應，不僅保護了實驗人員的健康，并且還能減少對環境的污染。

7 問題與展望

隨著人們生活水平的日益提高，食品安全問題越來越受到重視，解決AFM1 可能造成的污染問題迫在眉睫，因此，針對AFM1 檢測方法的研究就顯得尤為重要。TLC 只能定性不能定量，且耗時長;HPLC 操作繁瑣，儀器昂貴，且需要專業的人才，而免疫學檢測方法因其操作簡單，耗時較短，且靈敏度高，特異性好等優點被廣泛的應用于實際生產中。ELISA 方法大大提高了AFM1 的檢測效率，電化學免疫傳感器法則是在ELISA 方法的基礎上從技術上提高了檢測AFM1 的靈敏度，免疫熒光法是在電化學免疫傳感器法下加入熒光標記物，擴大了檢測AFM1 的范圍。膠體金免疫層析法就是在免疫熒光法的啟發下，利用膠體金本身的顯色特點結合ELISA 方法，使檢測極限顯著提高得同時縮短了檢測時間。而應用噬菌體展示技術篩選毒素模擬表位肽，可減少AFM1 測定中所使用的AFM1 標準品對試驗人員及環境的危害。因此，把ELISA 技術與膠體金技術及噬菌體展示技術相結合，用于測定各種對人類及環境可能有毒害作用的物質，必將成為一種趨勢，且擁有十分廣闊的前景。

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