c-Rel 轉錄因子對T 淋巴細胞免疫調控的研究進展①

王紹文 萬曉春 阮慶國 (中國科學院深圳先進技術研究院，深圳 518055)

1 NF-κB 及c-Rel 概述

T 淋巴細胞(T 細胞)是淋巴細胞的一種，在免疫反應中扮演著重要的角色。根據效應功能，T 細胞可分為輔助性T 細胞(help T cell，Th)、細胞毒性T 細胞(Cytotoxic T cell，Tc 或CTL)和調節性T 細胞(regulatory T cell，Tr 或Treg)等。而輔助性T 細胞又可分為Th1、Th2、Th17、Th9 和Tfh(follicular helper T cell)細胞［1］。NF-κB 是廣泛存在于哺乳動物細胞中的重要轉錄調控因子，最初從成熟的B 淋巴細胞中分離出來，因其能夠與B 淋巴細胞免疫球蛋白的κ 輕鏈基因增強子κB 序列特異結合而得名［2］。Rel/NF-κB 家 族 由 五 個 成 員 組 成:c-Rel、NF-κB1(p50/p105)、NF-κB2(p52/p100)、RelA(p65)和RelB［3］。這些家族成員的NH2 末端有一個約300個氨基酸的高度保守Rel 同源結構域，其內含有DNA 結合位點、蛋白二聚化區域及核定位信號。因此，NF-κB 轉錄因子可以形成不同的同源或異源二聚體以調控特異靶基因的表達［4］。通過小鼠基因敲除實驗，研究者發現NF-κB 在T 細胞的發育與效應功能中起著重要作用［1，5］。T 細胞在胸腺中發育經歷CD4+CD8+(Double negative，DN)、CD4+CD8+(Double positive，DP)及 CD4+或 CD8+(Single positive，SP)三個主要階段，最后進入外周淋巴組織［6］。在DN 階段，NF-κB 維持DN 細胞的存活;在DP 陰性選擇階段，NF-κB 對DP 胸腺細胞凋亡具有促進作用，而在DP 陽性選擇階段，NF-κB 對DP 胸腺細胞凋亡具有拮抗作用［7］。

與其他Rel/NF-κB 成員一樣，新合成的c-Rel與κB 抑制因子(Inhibitor of κB 或IκB)結合，并以單體或二聚體蛋白的無活性形式存在胞漿中。至少存在5 種IκB，它們通過掩蓋Rel/NF-κB 的核定位信號從而阻礙其向細胞核轉位。腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α 或TNF-α)和TNF-β 的細胞因子受體、T 細胞和B 細胞抗原受體以及Toll 樣受體等可以激活Rel/NF-κB 轉錄因子，該過程涉及IκB 蛋白激酶(IκB kinase 或IKK)介導的IκB 磷酸化并降解［8］。游離的Rel/NF-κB 轉錄因子同源或異源二聚體進入細胞核并結合到靶基因啟動子9～10 bp 的Rel/NF-κB 結合位點。目前，通過啟動子轉錄激活或者染色質免疫沉淀實驗(Chromatin immunoprecipitation 或ChIP)從不同類型哺乳動物細胞中鑒定了30 多個c-Rel 直接調控的靶基因，通過對c-Rel 基因敲除小鼠的研究發現c-Rel 在調節T細胞的活化，增殖和分化中起著重要作用［9，10］。

2 c-Rel 調節T 細胞的活化與增殖

初始T 細胞從胸腺轉移出周圍淋巴組織后，由細胞因子以及自身抗原誘導的弱TCR 信號的共同作用保持初始狀態［11］。在TCR 信號［初始T 細胞表面TCR 受到抗原呈遞細胞(APC)如樹突狀細胞(DC)呈遞的抗原的刺激］和共同刺激信號的作用下T 細胞開始活化。初始T 細胞中NF-κB 活性很小，處于靜息期的T 細胞細胞質中c-Rel 只維持較低水平［12］。c-Rel 的缺失并不影響初始T 細胞穩態維持，說明c-Rel 在此過程中不起重要作用［13］。受到TCR 信號刺激后，在靜息狀態T 細胞細胞質中的RelA 被快速激活，然而c-Rel 的激活存在某種程度延遲。這是由于與RelA 結合的IκBα 受TCR 信號刺激后迅速被降解，而與c-Rel 結合的IκBβ 對蛋白酶體的降解并不那么敏感。c-Rel 和RelA 被招募到細胞核不同的動力學表明了在T 細胞活化過程中需要按時間順序激活獨特的 NF-κB 轉錄靶基因［7，14］。

IL-2 是自分泌依賴性T 細胞增殖所必需的細胞因子，受TCR 和CD28 信號刺激后通過c-Rel 的誘導進行表達［15］。c-Rel 與il2 基因座結合后改變該基因座的染色質結構，使其他轉錄因子得以進入，從而調控il2 基因轉錄［12］。這種調控方式與c-Rel 調控Treg 細胞Foxp3 基因的轉錄相似［16］，表明染色質結構的改變可能是依賴c-Rel 調控一些靶基因轉錄的共同特點。c-Rel T 細胞不能表達IL-2，因此在體外培養即使受到TCR 及CD28 的刺激也不能進行正常增殖［17］。最近的研究發現，c-Rel 對T 細胞增殖的調節可能依賴于不同的刺激信號。例如，在對弓形蟲(Toxoplasma gondii)的免疫應答中c-Rel 促進Th1 效應細胞的增殖［18］，然而在被流感感染的小鼠中c-Rel 并不是CD8+T 細胞分裂所必需［19］。這種差異在T 細胞活化中對c-Rel 的需要可能反映了由特異病原引起的刺激信號的種類不同。c-Rel 和RelA 雙缺失后，加入c-Myc 可以拯救T 細胞的生長缺陷，說明c-Rel 還可以促進c-Myc 依賴性有絲分裂原誘導的T 細胞的生長［14］。

3 c-Rel 調節T 細胞的分化

在TCR 信號、共同刺激信號和細胞因子的共同作用下，初始CD4+T 細胞活化并分化成熟為有功能的效應性輔助性T 細胞(Th 細胞)和調節性T 細胞。根據Th 細胞所分泌的細胞因子不同，將Th 細胞分為Th1、Th2 和Th17 等細胞亞群［1］。Th1 細胞主要產生干擾素-γ(IFN-γ)和干擾誘導蛋白-10(CXCL10，IP-10)等細胞因子和趨化因子，進而調節細胞免疫應答，在細胞內病原感染中發揮生物效應，并參與遲發型超敏反應、輔助細胞毒性T 細胞分化等;Th17 細胞是近幾年發現的新型輔助性T 細胞，因其分泌特異性效應分子IL-17 而命名為Th17 細胞［20］。Th17 細胞可介導炎性反應、自身免疫性疾病、腫瘤和移植排斥等的發生和發展，Th17 細胞的免疫反應失調與自身免疫性疾病有著密切的關系;調節性T 細胞主要產生IL-10 和TGF-β，其在維持機體免疫應答和防止自身免疫疾病方面具有非常重要的作用［13，21-23］。

3.1 c-Rel 調節Th1 細胞的分化 病原體進入細胞后，抗原呈遞細胞(樹突狀細胞或巨噬細胞)呈遞Ⅱ型MHC 復合體，與TCR 結合后促使Th1 細胞分化。激活的TCR 信號誘導轉錄因子T-bet 和GATA3 進行低水平表達。隨后T-bet 激活IL-12 受體表達，增加細胞對IL-12 的敏感性并通過抗原呈遞細胞產生的IL-12 進一步促進T 細胞的分化。IL-12 可以激活轉錄因子STAT4 的表達，同時，IFN-γ 與其受體的結合可激活STAT1 的表達，從而進一步促進T-bet的轉錄。最后，在c-Rel、T-bet、STAT4 和STAT1 的共同作用下Th1 細胞大量表達IFN-γ［1］。在轉基因小鼠中持續表達不可降解的IκB，導致NF-κB 不能被激活，從而使Th1 細胞的應答功能受損［24］。我們的研究發現，c-Rel 缺失的小鼠中T 細胞不能產生IFN-γ，而且Th1 介導的免疫應答存在缺陷［25］。c-Rel 的缺失導致APC 細胞產生的IL-12 p40、p35 大幅度減少，表明c-Rel 除了能直接調控T 細胞合成IFN-γ，還可能通過調控APC 細胞合成IL-12 從而間接調節Th1 細胞的分化［25］。然而，缺失c-Rel 并不影響T 細胞中T-bet 的表達水平，提示在Th1 細胞分化途徑中c-Rel 可能位于T-bet 下游。另外，通過免疫印跡分析，我們發現c-Rel 的缺失也不影響STAT-4 的表達或磷酸化［25］。

3.2 c-Rel 調節Th17 細胞的分化 在TGF-β 以及IL-6 或IL-21 作用下，Th17 細胞可由初始CD4+前體細胞誘導產生，然后在TNF-α 或IL-1β(抑制Th1 和Th2 細胞分化的炎癥細胞因子)的作用下進一步分化［26，27］。除了IL-1 和IL-6 以外，IL-23 可以穩定并維持Th17 細胞的增殖與最終分化狀態［28］。我們的研究發現，缺失c-Rel 的APCs 產生的p19 大幅度減少。由于p19 是IL-23 的亞基，因此c-Rel 可能通過調控APCs 產生IL-23 從而間接調節Th17 的分化。此外，我們的研究還發現在抗-CD3 和抗-CD28 的激活下，c-Rel 缺失CD4+T 細胞合成的IL-17A mRNA及蛋白質顯著降低。Th17 細胞的分化依賴于轉錄因子RORγT(Retinoid-related orphan receptor gamma T)、RORα 和STAT3［29］。我們的實驗結果表明，c-Rel 的缺失并不影響Stat3 的表達，Rel/NF-κB 通過調控RORγ 和RORγT 基因表達從而調節Th17 細胞的分化［30］。c-Rel 或p65 缺失的T 細胞中IL-17 的表達減少同時向Th17 細胞分化功能受損。此外，缺失c-Rel 的T 細胞中RORγ 和RORγT 的表達也顯著降低，這兩個基因的表達水平恢復正常后Th17 細胞分化的缺陷得到補償。RORγ 和RORγT 由同一基因Rorg 編碼，它們僅在N-末端的100 個核苷酸序列不一致。RORγ 與RORγT 的DNA 結合區域以及活性區域完全相同，均可以與Il17a 調控區域結合，提示RORγ 也可能參與Th17 細胞的分化。RORγ與RORγT 的基因表達分別由兩個不同啟動子調控，而這兩個啟動子均含有Rel/NF-κB 結合位點。以上結果表明c-Rel(可能聯合p65)能激活RORγ 與RORγT 基因的表達。另外，目前還沒有實驗結果證明c-Rel 能結合到IL-17a 基因調控區域從而直接調控其表達。應該指出，除了通過RORγ 與RORγT 影響Th17 細胞分化以外，其他c-Rel 靶基因也可以調控Th17 細胞的應答。例如IL-2 和Foxp3 能促進Treg 細胞分化并抑制Th17 細胞分化［16，31，32］，而IL-21 則能促進Th17 的分化［33］。

根據目前的研究進展，我們提出以下調控模型(圖1)。抗原呈遞細胞通過與TCR 和CD28 相互作用而激活CD4+T 細胞，TCR、CD28、IL-1 與IL-23 受體的結合激活IKKβ，進而使IκBα 磷酸化，釋放出c-Rel 和p65。游離的c-Rel/p65 二聚體轉入細胞核，并與Rorg 和Rorgt 基因啟動子結合，在NFAT 和Stat等其他因子的輔助下啟動Th17 細胞的分化。盡管Rorg 基因是Th17 細胞分化的特征，然而它自身的表達并不受譜系特異轉錄因子的調控［34］。這解釋了非譜系特異轉錄因子如c-Rel 如何通過譜系特異形式來調控基因的表達［32］。值得注意的是，目前為止只發現轉錄因子c-Rel 和p65 可以結合并激活Rorg 基因的啟動子。最近，Durant 等［35］證明Stat3可以結合Rorg 基因第一個內含子，但不結合該基因的啟動子。與Rorg 基因激活相關的其他轉錄因子還有待進一步研究。

Th17 細胞在自身免疫疾病發病機理中具有重要作用。c-Rel 缺失小鼠的Th17 細胞不能正常發育，c-Rel 的缺失是否影響Th17 細胞對自身抗原的應答?我們的研究結果表明，缺失c-Rel 的小鼠對實驗性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)的發生具有抗性。為研究c-Rel 的缺失對抗自身髓鞘少突膠質糖蛋白(Myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG)的Th17 應答的影響，我們用MOG 多肽免疫野生型和c-Rel 缺失的小鼠，2 周后檢測脾臟T 細胞對MOG的應答情況。通過分析IL-17 和IL-6 的合成，我們發現與野生型小鼠相比，c-Rel 缺失小鼠抗-MOG 的Th17 細胞應答顯著降低。為研究c-Rel 的缺失對其他自身免疫疾病的影響，我們將缺失c-Rel 的B6 小鼠與攜帶糖尿病抗原特異TCR 的轉基因NOD 小鼠(BDC2.5)進行雜交［36］。盡管這些小鼠具有混合的MHC 背景，但在環磷酰胺(Cyclophosphamide，CY)誘導下，所有野生型小鼠均患糖尿病，而缺失c-Rel的小鼠并不產生糖尿病。與以上結果一致的是，在抗-CD3(加或不加抗-CD28)的刺激下，缺失c-Rel 小鼠的脾臟細胞合成的IL-17A、IL-6、IL-2 和IFN-γ 水平顯著減少。綜上所述，c-Rel 缺失后小鼠自身免疫反應的Th17 細胞應答顯著降低。

自身免疫疾病的發生需要自身免疫反應的CD4+初始T 細胞分化為Th1 或Th17 效應細胞，非分化的自身免疫反應的初始T 細胞不具有致病性。缺失c-Rel 的小鼠對EAE 和T1D 具有抗性，說明c-Rel 介導的T 細胞分化可能在自身免疫疾病中的發生中具有重要作用［37，38］。

3.3 c-Rel 調節Treg 細胞的分化 Treg 細胞分為天然型Treg(nTreg)細胞和誘導型Treg(iTreg)細胞，前者在胸腺中產生，后者在周圍淋巴器官產生或在體外細胞培養時在抗原刺激及轉化生長因子-β(TGF-β)等細胞因子的誘導下產生［39-41］。Foxp3 是Treg 細胞的重要標志，參與了Treg 細胞表面很多分子的表達，影響著Treg 細胞的發育和免疫抑制功能。動物實驗表明，Foxp3 缺失小鼠呈現淋巴細胞過度增殖和侵潤及多器官自體免疫疾病［42］。在人類，與小鼠同源的Foxp3 基因突變可引起致命的IPEX 自身免疫失調綜合征(immune dysregulation，polyendocrinophty，enteropathy，X-linked)［43］。在c-Rel 缺失(c-rel)小鼠的胸腺中，只有約15% Treg 細胞獲得正常發育［44］。我們也比較了野生型和c-Rel缺失的C57BL/6 小鼠在第3、7、21 和42 天時胸腺產生的Treg 細胞數量和比例。c-Rel 缺失后，新生以及成年小鼠胸腺中CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的是野生型小鼠的10%。另一方面，c-Rel 缺失小鼠的CD4+CD25+Foxp3+T 細胞的比例與野生型小鼠相當。盡管c-rel 小鼠胸腺Treg 細胞總數大量減少，然而剩余的Treg 細胞中Foxp3 表達水平正常［45］，且在體外培養及體內條件下仍然具有正常免疫細胞抑制活性［44］。上述結果說明c-Rel 活性對胸腺Treg 細胞的發育有重要作用，但并不是維持成熟Treg 細胞功能所必需。

圖1 c-Rel-RORg-RORgT 信號通路調節Th17 細胞分化的模型Fig.1 c-Rel-RORg-RORgT axis that drives Th 17 differentiation

Grigoriadis 等［46］證明c-Rel 在nTreg 前體細胞正常數量的產生中起重要作用。另一方面c-Rel 也可通過間接調控IL-2 等細胞因子來影響Treg 的產生。盡管IL-2 在Treg 細胞發育中具有重要的促進作用［47］，并且缺失c-Rel 的T 細胞在體外培養時IL-2 的合成降低［48］，c-Rel 可以通過IL-2 以外的機制來影響Treg 的分化。我們及其他研究小組的結果表明，c-Rel 可以直接作用于Foxp3 基因并激活其轉錄［16，32，44，49］。c-Rel 和p65 的缺失可以阻斷Foxp3基因的表達以及Treg 細胞的分化。另一方面，c-Rel或p65 的過表達可增強Foxp3 基因啟動子的活性［32］。為研究Treg 細胞分化過程中調控Foxp3 基因表達的轉錄復合體，我們通過染色質免疫沉淀(ChIP)以及連續染色質免疫沉淀(SeqChIP 或Re-ChIP)分析，發現初始CD4+CD25+T 細胞中檢測不到轉錄因子與Foxp3 基因啟動子和增強子的結合。然而，在Treg 細胞分化的培養條件下，我們檢測到Foxp3 基因特異的增強子復合體，包括c-Rel、p65、NFAT、Smad 和CREB 等組分(圖2)。根據現有結果，我們推測Treg 細胞的分化經歷三個連續步驟:起始(Initiation)、選擇(Selection)以及固定(Fixation)。在起始階段，c-Rel 與Foxp3 基因啟動子和CNS3(Conserved non-coding DNA sequence 3)結合，促進增強子復合體形成和染色質結構改變，從而促使Foxp3 mRNA 的合成。在此過程中，其他與T 細胞分化相關的特異基因如T-bet 也可能被激活。在選擇階段，TGF-β 等細胞因子進一步促進增強子復合體介導的Foxp3 mRNA 的合成，同時抑制非Treg 細胞特異性基因的轉錄。TGF-β 可能通過Smad 途徑或不依賴Smad 的途徑實現上述功能。在固定階段，IL-2、TGF-β 等細胞因子聯合增強子復合體阻礙DNA 甲基轉移酶在DNA 復制階段與Foxp3基因位點結合，從而使Foxp3 基因位點去甲基化。因此，最終分化的Treg 細胞中Foxp3 基因具有兩種明顯的表觀遺傳特征:(1)開放的染色質結構;(2)調控區域的去甲基化。

此外，c-Rel 不僅參與Treg 細胞的分化，還參與周圍淋巴組織Treg 細胞的穩定增殖［50］。

4 c-Rel 在T 細胞相關炎癥、自身免疫性疾病及腫瘤中的作用

圖2 Treg 細胞分化的Foxp3 增強子復合體(enhanceosome)模型(引自文獻［10］并作修改)。Fig.2 Foxp3 enhanceosome model for Treg cell differentiation (cited from［10］with modification)

越來越多的研究表明c-Rel 轉錄因子與人類疾病如腸炎(IBD)［51］、類風濕性關節炎(RA)［52］、I 型糖尿病(TID)［37］及淋巴細胞瘤等疾病相關。IBD 是由于免疫系統對正常腸道菌群進行異常的免疫應答而導致慢性腸道炎癥。Wang 等［53］發現缺失了c-Rel 的T 細胞不能在RAG-2 小鼠中誘導IBD。這是由于 c-Rel 的缺失導致 IL-23 的產生缺陷，而IL-23是IBD和結腸炎的關鍵致病細胞因子，它促進CD4+記憶T 細胞的活化并遷移到結腸。活化的CD4+記憶T 細胞產生過量的IL-17 和IL-6 等促炎因子，激活并加劇對IBD 的炎癥性應答。類風濕性關節炎(RA)是一種以關節滑膜炎為特征的慢性自身免疫性疾病。c-Rel 原小鼠的研究結果表明RA的發生發展與c-Rel 轉錄因子相關［54］。膠原蛋白Ⅱ可以誘導關節炎(CIA)模型小鼠，當c-Rel 缺失后，c-rel 小鼠對膠原蛋白Ⅱ的誘導具有抗性，不容易發生RA，該結果表明c-Rel 在RA 發生發展中起重要作用。最近，Niu 等［33］發現IL-21 對Th17 細胞的調控作用。在RA 病人的關節液中，IL-21 表達水平明顯增加并誘導T 細胞增殖導致RA 的病情加重。由于c-Rel 可直接調控IL-21 的合成，因此c-Rel 有可能成為治療RA 的新靶點。Ⅰ型糖尿病(TID)是一種胰腺自身免疫性疾病，自身反應性T 細胞特異地靶向并誘導胰島β-細胞的凋亡，從而導致糖尿病。越來越多的證據表明，c-Rel 在TID 中起重要作用。例如，我們的研究結果發現c-Rel-/-小鼠對鏈脲霉素和環磷酰胺誘導的糖尿病具有抗性，其原因可能是Th1 和Th17 細胞應答的缺陷而致［30，55］。此外，REL基因的擴增、重排、點突變以及mRNA 和蛋白表達異常與人類B 細胞、T 細胞惡性淋巴瘤的發生發展密切相關［56］。例如，在霍奇金淋和非霍奇金B 細胞淋巴瘤、慢性淋巴細胞性白血病及T 細胞淋巴瘤中都發現REL 基因拷貝數有不同程度的擴增［3］。

5 展望

NF-κB 是調控免疫應答、細胞凋亡和細胞周期的關鍵轉錄因子。NF-κB 特別是c-Rel 不僅參與促炎癥反應的調節，還能促進Treg 細胞的分化與發育。然而，c-Rel 如何調控Treg 發育還需要進一步的研究。Foxp3 基因含有四個c-Rel 結合位點:啟動子含兩個，CNS2 和CNS3 各含一個。這些位點對于Treg 細胞分化與發育的功能有待進一步研究。需要指出的是，nTreg 細胞和iTreg 細胞在分化過程中對c-Rel 的依賴程度可能不同。另外，雖然缺失c-Rel 的Treg 細胞與野生型Treg 細胞相比對抑制T細胞增殖的功能相當，c-Rel 的過度表達(如炎癥情況)可能會抑制Treg 細胞的功能。以上研究結果不僅可以加深我們對NF-κB 在機體免疫系統中功能的理解，還將為治療炎癥疾病、自身免疫性疾病以及淋巴瘤的新藥設計提供新的靶點。

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