3種檢測(cè)生殖器皰疹方法的對(duì)比研究

張 帆，莫銀娟，朱麗婷(南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院皮膚科，廣州 510282)

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·論 著·

3種檢測(cè)生殖器皰疹方法的對(duì)比研究

張 帆，莫銀娟，朱麗婷
(南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院皮膚科，廣州 510282)

目的 尋找更為準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用的生殖器皰疹病毒感染的檢測(cè)方法。方法 取根據(jù)病史及典型的臨床癥狀表現(xiàn)的生殖器皰疹疑似病例患者標(biāo)本50例，分別采用病毒培養(yǎng)、熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-PCR)及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) 3種方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，比較各種方法檢測(cè)的陽(yáng)性率。結(jié)果 病毒培養(yǎng)陽(yáng)性30例，陽(yáng)性率60.0%；FQ-PCR檢測(cè)陽(yáng)性34例，陽(yáng)性率68.0%；ELISA檢測(cè)陽(yáng)性32例，陽(yáng)性率64.0%，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，三者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.69，P>0.05)。水皰和膿皰標(biāo)本的陽(yáng)性率分別為94.6%和83.3%，明顯高于其他來(lái)源標(biāo)本的陽(yáng)性率。結(jié)論 3種檢測(cè)方法對(duì)臨床疑似生殖器皰疹患者的檢測(cè)陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。相對(duì)另外兩種檢測(cè)方法，ELISA因其便宜、實(shí)用的優(yōu)點(diǎn)而適用于臨床推廣應(yīng)用。水皰和膿皰標(biāo)本陽(yáng)性率明顯高于其他類(lèi)型標(biāo)本的陽(yáng)性率，對(duì)臨床疑似病例的實(shí)驗(yàn)診斷，標(biāo)本以采集水皰和膿皰液為佳。

生殖器皰疹； 病毒培養(yǎng)； 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)； 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

單純皰疹病毒(HSV)包括HSV-1和HSV-2兩個(gè)血清型，HSV感染引起皰疹性口腔炎、眼炎、腦炎及生殖器炎等諸多臨床表現(xiàn)[1]。而生殖器皰疹是臨床最常見(jiàn)的一種性傳播疾病，具有反復(fù)發(fā)作及癌變特性，對(duì)患者的身心健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅[2-4]。引起生殖器皰疹的主要病毒類(lèi)型為HSV-2，約占90%[5]，HSV-1和混合型只占很少的一部分。本文主要研究的是檢測(cè)HSV-2感染。該病的診斷主要依據(jù)臨床表現(xiàn)，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。目前，HSV-2的實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要有病毒分離培養(yǎng)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)及血清抗體檢測(cè)等方法。其中，病毒分離培養(yǎng)為“金標(biāo)準(zhǔn)”。但病毒培養(yǎng)操作難度大，時(shí)間周期長(zhǎng)(一般需要4～7 d)，條件要求嚴(yán)格，很難在臨床推廣。而熒光定量PCR(FQ-PCR)檢測(cè)結(jié)果特異性和敏感性都高，但費(fèi)用昂貴。作者采用3種檢測(cè)方法對(duì)50例生殖器皰疹臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)并對(duì)比分析，以幫助找到一種適合于臨床實(shí)驗(yàn)廣泛應(yīng)用的有效檢測(cè)HSV-2的方法。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本采集 臨床疑似生殖器皰疹患者50例均來(lái)自2014年8月至2015年2月珠江醫(yī)院皮膚科門(mén)診就診患者，其中男37例，女13例；年齡19～56歲。具有臨床癥狀的患者先暴露皮損部位，采集皰液、膿皰液或潰瘍面痂面皮屑；無(wú)臨床癥狀的患者，男性采集前2 h內(nèi)未排尿，尿道口內(nèi)1～3 cm取材，女性宮頸口內(nèi)1～3 cm取材。

1.2 病毒分離培養(yǎng)

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 培養(yǎng)病毒細(xì)胞采用A549(肺腺癌細(xì)胞)，來(lái)自The American Type Culture Collection (ATCC)。A549使用含10%胎牛血清(Hyclone公司)的低糖DMEM培養(yǎng)液(美國(guó)Invitrogen公司)，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，胰酶消化，轉(zhuǎn)至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)至單層。

1.2.2 臨床標(biāo)本接種 將病毒運(yùn)送液搖勻，取0.2 mL經(jīng)處理標(biāo)本接種于細(xì)胞培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，以便病毒吸附，然后加入2 mL含2%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，36 ℃、5%CO2的培養(yǎng)并觀察細(xì)胞形態(tài)改變。

1.2.3 細(xì)胞觀察 將培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次，取0.2 mL培養(yǎng)物接種到新HEP-2細(xì)胞管中，經(jīng)培養(yǎng)后，將HEP-2細(xì)胞管用吸管吹打下來(lái)，以200×g離心10 min，棄上清液，將沉淀混懸液加入100 mL、pH 7.2的PBS中，取25 mL滴于載玻片上，并涂成1 cm圓膜，干燥后，丙酮固定10 min，用HSV單克隆抗體(達(dá)科生物技術(shù)有限生物公司)染色，熒光顯微鏡觀察。

1.3 FQ-PCR檢測(cè)

1.3.1 DNA模板制備 試劑購(gòu)自達(dá)安基因股份有限公司。用無(wú)菌生理鹽水洗脫拭子的分泌物或皰液。10 000×g離心10 min，棄上清液，沉淀加50 μLDNA提取液，100 ℃干浴10 min，10 000×g離心5 min，取5 μL上清液作PCR擴(kuò)增模板。

1.3.2 引物設(shè)計(jì) 設(shè)計(jì)引物序列為P1：5′-AGGAGTGGCTGGCGCGACC-3′；P2：5′-ATCCGGTCCTTGATGGACG-3′。取5 μL模板提取液加入到HSV-2反應(yīng)管中，各反應(yīng)管放入LIGHTCYCLER型PCR儀中，擴(kuò)增93 ℃ 2 min后93 ℃ 5 s，57 ℃ 45 s，40個(gè)循環(huán)后再37℃ 1 s。循環(huán)結(jié)束后，自動(dòng)讀取定量結(jié)果值。

1.4 ELISA檢測(cè) ELISA試劑盒購(gòu)自DAKO公司。恢復(fù)至室溫，取200 μL標(biāo)本液加入96孔聚乙烯酸標(biāo)板各反應(yīng)孔，另取陰陽(yáng)性對(duì)照各200 μL加入反應(yīng)孔。各孔加酶結(jié)合物50 μL，37 ℃孵育90 min，洗滌4次，加底物A、B各100 μL，振蕩30 min，加硫酸終止液100 μL，450 nm酶標(biāo)儀測(cè)A值，A>CO+0.015為陽(yáng)性，表示有皰疹病毒感染。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

在50例標(biāo)本中，經(jīng)病毒培養(yǎng)法檢測(cè)，30例陽(yáng)性，陽(yáng)性率60.0%。FQ-PCR檢測(cè)陽(yáng)性34例，陽(yáng)性率68.0%。ELISA檢測(cè)陽(yáng)性32例，陽(yáng)性率64.0%。3組檢測(cè)方法陽(yáng)性檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.69，P>0.05)。

從取材的結(jié)果類(lèi)型來(lái)看，水皰和膿皰標(biāo)本檢出的陽(yáng)性率較高，分別為94.6%和83.3%，明顯高于其他取材類(lèi)型的標(biāo)本陽(yáng)性率(糜爛38.8%，痂面20.0%，拭子16.6%)。見(jiàn)表1。

表1 50例臨床標(biāo)本的病毒培養(yǎng)、FQ-PCR和ELISA的檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

生殖器皰疹是由HSV感染泌尿生殖器及肛門(mén)周?chē)つw黏膜而引起的一種慢性、復(fù)發(fā)性、難治愈的性病，該病臨床表現(xiàn)多樣，多發(fā)且具有致癌、致畸性。近年研究發(fā)現(xiàn)，生殖器皰疹患者較健康人更易感染HIV[6-7]。臨床上典型病例可以根據(jù)病史和臨床表現(xiàn)診斷，但很多病例臨床表現(xiàn)不典型或處于亞臨床感染狀態(tài)，一些病例合并其他感染，如梅毒、尖銳濕疣及念珠菌等[8]，因此實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)對(duì)于生殖器皰疹的診斷非常必要。隨著醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)的發(fā)展，生殖器皰疹實(shí)驗(yàn)室診斷方法亦有了很大發(fā)展，病毒培養(yǎng)法、抗原檢測(cè)法、FQ-PCR及抗體檢測(cè)法等相繼應(yīng)用于HSV感染的檢測(cè)[9-10]。目前，病毒的分離培養(yǎng)法是國(guó)際公認(rèn)的診斷生殖器皰疹的金標(biāo)準(zhǔn)，但操作復(fù)雜費(fèi)時(shí)、技術(shù)要求高，并且分離培養(yǎng)的成功率與標(biāo)本采集、標(biāo)本中活病毒數(shù)量以及標(biāo)本的運(yùn)送和保存等多種因素有關(guān)[11]，難以成為檢測(cè)HSV-2的臨床常規(guī)方法。隨著檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，F(xiàn)Q-PCR逐漸取代傳統(tǒng)的PCR檢測(cè)法。FQ-PCR由于多使用了一條與模板互補(bǔ)配對(duì)的核酸探針，因此比傳統(tǒng)PCR法具有更高敏感性和特異性[12]，同時(shí)減少了假陽(yáng)性的概率。但FQ-PCR所需檢測(cè)儀器價(jià)格昂貴，實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所要求必須達(dá)到國(guó)家規(guī)定的PCR實(shí)驗(yàn)室條件，且實(shí)驗(yàn)操作人員必須經(jīng)嚴(yán)格的崗前培訓(xùn)并具有相應(yīng)的資質(zhì)。而ELISA方法具有方便、快速及費(fèi)用低等有點(diǎn)，且實(shí)驗(yàn)條件要求不高。國(guó)外研究證實(shí)，ELISA(DAKO試劑盒)檢測(cè)皰疹病毒抗原有較高的敏感性和特異性[13]。在本研究中，作者發(fā)現(xiàn)3種檢測(cè)方法對(duì)HSV-2的檢測(cè)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示用相對(duì)簡(jiǎn)單的ELISA代替其他兩種方法檢測(cè)HSV-2的可行性。本試驗(yàn)中，還發(fā)現(xiàn)不同的標(biāo)本來(lái)源，檢測(cè)結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中水皰和膿皰的標(biāo)本陽(yáng)性率明顯高于其他類(lèi)型的標(biāo)本，提示水皰和膿皰中病毒的活力最強(qiáng)或處于病毒復(fù)制期，而其他類(lèi)型標(biāo)本中的活力明顯減弱甚至消失。提示實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)生殖器皰疹，標(biāo)本的采集最好為水皰或膿皰的皰液。

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Contrastive study on three methods in detection of genital herpes virus

ZHANGFan,MOYin-juan,ZHULi-ting
(DepartmentofDermatology,ZhujiangHospitalofSouthernMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510282,China)

Objective To search for a more accurate,economic and practical detection method of genital herpes virus (HSV).Methods 50 specimens were collected from the suspected as genital herpes according to the disease history and the typical clinical symptoms and tested by adopting 3 kinds of method:virus culture method，fluorescence quantitative-PCR (FQ-PCR) and ELISA.The positive rates were compared among 3 kinds of method.Results 30 cases were positive in the virus culture,the positive rate was 60.0%,34 cases were positive in FQ-PCR with the positive rate of 68.0%,32 cases were positive in ELISA with the positive rate of 64.0%,the differences were not statistically significant(χ2=0.69，P>0.05).However,the positive rates of blister and pustules specimens were 94.6% and 83.3% respectively,which were significantly higher than those of other sources of samples.Conclusion The positive rate of clinically suspected genital herpes detected by using three methods had no statistically significant difference.ELISA is more suitable for clinical application compared with other two methods because of cheap and convenient advantages.The positive rate of blister and pustules specimens is significantly higher than that of other types of samples,therefore in the laboratory diagnosis for the suspected case,collecting the blister and pustules samples is best.

genital herpes； virus culture； FQ-PCR； ELISA

張帆 男，副主任技師，碩士，主要從事皮膚性病檢驗(yàn)和腫瘤病理研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.21.019

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1672-9455(2015)21-3182-02

2015-04-29

2015-06-24)