非小細胞肺癌靶向基因研究新進展

郭永軍

(鄭州大學附屬腫瘤醫院 分子病理科 河南 鄭州 450008)

30年來，我國肺癌死亡率增長465%，肺癌在全部因癌癥死亡患者中占22.7%，其中85%是非小細胞肺癌，肺癌已成為我國因癌癥死亡患者的第一殺手，嚴重威脅人民群眾的生命健康。隨著分子生物學的發展，基因改變的檢測及相應靶向藥物的研發使得肺癌的治療水平得到極大提高。基因檢測繼以靶向藥物治療標志著肺癌進入個體化治療的時代，大大延長了肺癌患者的生存期。近年來基因檢測日益常規化，本文以EGFR 和ALK 為例綜述非小細胞肺癌靶向基因研究的新進展及技術革新對基因檢測的改變，以利于相關臨床醫師和基礎研究人員了解相關研究進展。

1 EGFR 研究現狀

表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是ErbB 家族成員之一，與配體結合后，EGFR 同源或異源二聚體聚集，激活PI3K/AKT 和RAS/RAF/MAPK 細胞信號通路。在非小細胞肺癌(non－small cell lung cancer，NSCLC)中，EGFR 突變集中在18 ～21 外顯子，其中19 和21 外顯子突變最為常見，突變可導致受體酪氨酸激酶結構域異常活化，引起細胞向惡性轉化。NSCLC 中EGFR 突變率在北美和西歐人群中為10%左右，而在東亞人群中為30% ～50%，其中在亞裔、女性、非吸煙、腺癌患者中EGFR 突變率甚至高達70% ～80%［1］。表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR－TKIs)廣泛用于治療晚期NSCLC，其療效已經得到廣泛認可。

2005年吉非替尼(易瑞沙)進入中國市場，10年來在政府和公司的大力推動下，EGFR 突變檢測逐漸普及，到2014年我國已有超過100 家醫院建立EGFR 突變的院內檢測平臺，為肺癌個體化治療和臨床研究提供了保障。在此背景之下，EGFR 的研究開始走向更多功能的研究和更靈敏檢測方法的研發。

1.1 EGFR 在腫瘤異質性中研究 許多研究者提出了原發灶和轉移灶EGFR 突變異質性的假設，并進行了多項研究［2］。Gow 等［3］研究67 例NSCLC 患者的原發灶和轉移灶EGFR 的突變情況發現，原發灶EGFR 突變呈陽性的患者中有50%(9/18)在轉移灶中突變丟失，轉移灶EGFR 突變呈陽性的患者中有65%(17/26)在原發灶是陰性的。利用擴增阻滯突變系統法檢測，發現該樣本EGFR 異質性達到27%(18/67)。我們團隊用EGFR 定量的方法檢測原發與轉移灶之間的突變發生率的關系，50 例NSCLC 患者中相符率為84%，16%患者在原發灶中檢測到10%以上的EGFR 突變，而在轉移灶中并未檢測到［4］。利用EGFR 突變狀態研究腫瘤異質性，其結果表明腫瘤狀態是繁雜而充滿變化的，這令我們對單次檢測EGFR 狀態而指導臨床靶向用藥的合理性提出質疑。

1.2 EGFR T790M 突變研究 目前存在爭議的是T790M 突變是原發的，還是EGFR－TKIs 治療后新出現的。大多數研究是在EGFR－TKIs 出現耐藥的患者中發現T790M 突變，認為T790M 突變是EGFR－TKIs 治療導致的［5］，但后來在未經任何治療的患者標本中也發現T790M 突變。因此，有學者提出T790M 突變原發存在，由于這些細胞抵抗EGFR－TKIs，治療后以優勢細胞群體顯現出來［6］。此外，在耐藥患者樣本中還相繼發現了D761Y、L747S、T854A 等突變［7－9］，這些突變均可能參與耐藥，被稱為“非T790M 繼發突變”。

1.3 EGFR 突變亞型研究 EGFR 中最常見改變是19外顯子缺失及21 外顯子L858R 突變。我們研究發現，19外顯子缺失相對21 外顯子突變在女性患者中突變率更高［10］。Li 等［11］研究顯示，21 外顯子突變的肺癌惡性程度可能更高，19 外顯子缺失以左肺居多，而21 外顯子突變多發生在右肺。但是國內其他研究卻顯示，19 外顯子缺失以右肺原發更常見［12］。目前，是否可將二者區別對待仍存在爭論。Riely 等［13］通過對34 例肺癌患者應用EGFR－TKIs 治療發現，21 外顯子突變患者無進展生存時間(progression－free survival，PFS)及總生存期(overall survival，OS)明顯低于19 外顯子突變患者。Mitsudomi等［14］報道，相比其他EGFR 突變類型肺癌患者而言，EGFR19 外顯子缺失肺癌患者對吉非替尼的反應率更高。Zhu 等［15］從細胞水平分析了EGFR19 外顯子缺失突變和21 外顯子點突變對吉非替尼反應性不同的原因，發現吉非替尼均能導致EGFR19 外顯子缺失突變和EGFR21 外顯子點突變的穩定轉染細胞EGFR、Akt 和Erk 分子磷酸化受到抑制，但對前者的抑制較后者更明顯。而與21 外顯子點突變的細胞比較，吉非替尼能導致更多的19 外顯子缺失的細胞G1 期阻滯。

1.4 基于EGFR 狀態的靶向聯合化療臨床研究 EGFRTKIs 在EGFR 基因突變的晚期NSCLC 患者一線、二線、維持治療等領域中都不遜色于傳統化療，靶向治療的應用不僅僅局限于單純靶向治療，還拓展至靶向聯合化療。

日本一項關于NSCLC 患者吉非替尼術后輔助化療的回顧性研究結果顯示，EGFR 基因突變患者比野生型患者的中位OS 顯著延長(930 d vs 210 d，P ＜0.01)。但是回顧性研究并不能成為可靠證據，仍需更多前瞻性研究予以證實。2013年ASCO 上一項中國啟動的Ⅱ期隨機臨床試驗表明，針對EGFR 突變型的術后ⅢA 期NSCLC 患者，以EGFR基因狀態為前提，進行帶或不帶吉非替尼的培美曲塞聯合卡鉑輔助治療，盡管靶向治療組的OS 絕對值延長，但差異無統計學意義。

我國NCT01410214 和NCT01683175 兩項臨床研究均為厄洛替尼輔以長春瑞濱聯合順鉑治療ⅢA 期NSCLC 切除術后EGFR 基因19 外顯子或21 外顯子突變患者，以2年DFS作為主要研究終點。廣東臨床試驗協會NCT01405079 項目是2011年啟動的一項為期8年的Ⅲ期臨床試驗，以吉非替尼聯合長春瑞濱或順鉑治療EGFR 基因發生突變的Ⅱ～ⅢA(N1 ～N2)期NSCLC 者。

目前支持早期NSCLC 術后輔助EGFR－TKIs 治療能有效延長DFS 和OS 的循證醫學證據并不充分，在EGFR基因突變狀態的基礎上，需要更多的前瞻性、多中心、隨機、與標準化療方案對照的臨床試驗數據支撐。

1.5 EGFR 新技術檢測 隨著數字PCR(Digital PCR)技術的日益成熟，由于其靈敏度較高，研究者將目光逐漸轉向血循環中的微量基因的檢測。Zhang 等［16］比較了ARMS－qPCR 方法和數字PCR 的檢測靈敏度。ARMS－qPCR 方法檢測到1% ～5%的突變頻率，而數字PCR 則可以檢測到低至0.1% 的突變，同時還檢測出1 例經ARMS－qPCR 方法未檢出的T790M 突變(7/6 000)，顯示出數字PCR 在檢測稀有突變中的優勢。數字PCR 甚至可以將靈敏度提升到0.04%［17］。由于血液檢測屬于無創、動態檢測，對于術后及難以取到樣本的患者而言將具有很大的臨床使用價值，該技術在經過數據驗證之后將有可能在未來逐漸應用用于臨床檢測。

2 ALK 融合基因研究現狀

間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)基因是胰島素受體超家族的成員，20年前首次以NPM－ALK 融合基因的形式在間變性大細胞淋巴瘤中被發現［18］，2007年Soda 等［19］在75 例NSCLC 患者中發現5例攜帶棘皮動物微管相關蛋白樣4(echinoderm microtubule－associated protein－like 4，EML4)ALK 融合突變基因，并且發現EML4－ALK 融合基因有致瘤性。EML4 與ALK 基因都位于2 號染色體短臂上，由于其中1 個基因倒置而產生EML4－ALK 融合基因。相關研究已經證實，EML4－ALK 可通過絲裂原活化蛋白激酶－分裂原活化蛋白激酶－細胞外調節蛋白激酶、磷脂酰肌醇3－激酶－蛋白激酶B 和ras 信號傳導及轉錄激活因子－3 信號通路促進腫瘤細胞的增殖、分化、抗凋亡［20］。ALK 是NSCLC 的關鍵啟動癌基因，雖然只有5%的NSCLC 患者出現ALK 基因融合［21］，但由于具有明確的分子靶點，確診ALK 基因融合將會使患者從靶向藥物治療中獲益［22］。

2.1 ALK 基因融合檢測技術 目前熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，FISH)是美國FDA 唯一批準的檢測ALK 基因融合的方法［23］，是檢測EML4－ALK融合基因的金標準。免疫組織化學(immunohistochemistry，IHC)是一種經濟簡便的診斷方法，其敏感性低于FISH 法，可用作FISH 法前對EML4－ALK 融合基因的預篩查。研究表明，使用單克隆抗體能提高IHC 法檢測的敏感性和特異性［24］。Fukuyoshi 等［25］利用RT－PCR 分別檢測了104 例肺癌，僅1 例肺癌標本中發現了EML4－ALK 的mRNA，顯示PCR 方法檢測ALK 融合基因仍需優化。高通量測序的確可以發現未知的融合類型，但是目前測序成本太昂貴，令其不太適合在臨床上應用。2014年Zheng 等［26］使用新型錨定多重PCR(anchored multiplex PCR)，通過引物設計和高通量測序對986 例患者石蠟樣本進行檢測，在不同腫瘤中發現了9 種新的融合基因，展現出其檢測未知融合基因的強大能力。

2.2 ALK 耐藥研究 克唑替尼治療ALK 陽性的NSCLC患者常常在1 a 內出現藥物抵抗，并發生中樞神經系統轉移，可能與克唑替尼在腦脊液中的濃度遠低于血漿有關［27］。關于耐藥機制研究，體外實驗顯示不同ALK 融合類型對藥物的敏感性不同，顯示可能存在不同原發融合類型導致耐藥的出現［28］。但是臨床實驗結果卻不支持這一觀點［29］。耐藥機制可能涉及到基因突變和基因擴增，其中突變代表是L1196M 突變，類似于T790M 突變，L1196M 突變導致構象變化、激酶活性增加，繼而導致耐藥。其他耐藥突變還有G1269A、C1156Y、L1152R、G1202R、S1206Y、1151Tins、F1174C、D1203N［30］。

2.3 新藥開發 針對克唑替尼的耐藥現象，制藥企業也在加快新藥的研發。FDA 2011年快速批準克唑替尼上市，2014年又批準了第2 代靶向藥物色瑞替尼(Ceritinib)用于克唑替尼不耐受的ALK 陽性患者［31］。目前，針對ALK－L1196M 和EGFR－T790M 雙突變的口服TKI AP26113［32］和 針 對ALK－L1196M 及C1156Y 突 變 的CH5424802［33］均在臨床實驗中。另一類新藥是HSP90 抑制劑，作為分子伴侶抑制劑，通過穩定和調節ALK 蛋白，加快其蛋白降解從而達到治療效果［34］。目前HSP90 抑制劑類新藥如Ganetespib［35］、Onalespib［36］、IPI－504［37］等均處于研發中。

3 結語

我國正處于社會高速發展階段，老齡化進程、空氣污染、環境污染、社會壓力、吸煙習慣等導致肺癌高發，這已經成為非常嚴峻的社會問題。從全國來看，基因檢測率只有27%，與日本、韓國以及香港、臺灣地區超過80%的檢測率差距較大，我國基因檢測普及亟待進一步加強。我國與國外相比在基因基礎研究方面仍存在不小差距;在臨床研究方面基本處于國際先進水平，但仍需研究成果來奠定國際地位;在新藥研發方面與國外相比顯示出巨大差距，我國新藥研發將任重道遠。最后應該關注新技術在基因檢測領域帶來的變化，高通量測序、液體活檢、大數據分析、數字PCR 等新技術新理念可能在未來給該領域帶來革命式的改變。

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