microRNA-21對肺癌A549細(xì)胞增殖和Smad7表達(dá)的影響

李 斌，潘躍銀，杜瀛瀛

microRNA-21對肺癌A549細(xì)胞增殖和Smad7表達(dá)的影響

李 斌，潘躍銀，杜瀛瀛

目的探討微小RNA-21（miR-21）對肺癌A549細(xì)胞中Smad7表達(dá)的調(diào)控和對肺癌A549細(xì)胞增殖的影響。方法常規(guī)培養(yǎng)肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染miR-21模擬物和抑制物及陰性對照片段48 h后，采用Western blot、qRTPCR法檢測Smad7基因及蛋白的表達(dá)水平，MTT法檢測A549細(xì)胞增殖情況。結(jié)果轉(zhuǎn)染miR-21模擬物后Smad7的mRNA和蛋白表達(dá)量降低（P＜0.05），而轉(zhuǎn)染miR-21抑制物后Smad7的mRNA和蛋白表達(dá)量升高（P＜0.05）；MTT結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-21模擬物后細(xì)胞的增殖能力明顯增強(qiáng)（P＜0.05），而轉(zhuǎn)染miR-21抑制物后細(xì)胞增殖能力明顯減弱（P＜0.05）。結(jié)論通過下調(diào)miR-21可提高Smad7的mRNA和蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制A549細(xì)胞的增殖。

肺癌；微小RNA-21；Smad7；增殖

肺癌是威脅人類健康最常見的惡性腫瘤之一，惡性死亡率逐年上升［1］。微小RNA（microRNA，miR）是近年來發(fā)現(xiàn)的一類長約19～22個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，其能與靶序列mRNA的3’非翻譯區(qū)結(jié)合，時序性調(diào)控基因表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞增殖、分化和凋亡中發(fā)揮重要的調(diào)控作用［2］。文獻(xiàn)［3］報道，miR-21在肺癌細(xì)胞中高表達(dá)，但作用機(jī)制尚不清楚。研究［4］證實，miR-21通過作用于Smad7調(diào)控肺成纖維細(xì)胞的活化增殖。Smad7是轉(zhuǎn)化生長因子-β1／Smad信號通路負(fù)調(diào)控因子，抑制細(xì)胞活化增殖［5］。miR-21是否靶向調(diào)控Smad7表達(dá)，影響肺癌A549細(xì)胞增殖目前尚不十分清楚。該研究旨在探討miR-21對肺癌中Smad7表達(dá)的調(diào)控和A549細(xì)胞增殖的影響，以期為研究miR-21在肺癌中的作用以及肺癌基因治療新靶標(biāo)開發(fā)提供前期實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑一抗Smad7購自美國Cell signal公司；β-actin購自武漢博士德生物工程有限公司；辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購自美國Santa Cruz公司；miR-21模擬物和抑制物、EzOmics miRNA qPCR Detection Primer試劑盒、EzOmics One-Step qPCR試劑盒購自美國Biomic公司；LipofectamineTM2000 Reagent、TRIzol Reagent購自美國Invitrogen公司；RT-PCR試劑盒、SYBRGreen qPCR Master Mix購自立陶宛MBI Fermentas公司；引物合成均由上海生工生物工程有限公司提供。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞庫。在含100 ml／L胎牛血清、100 U／ml青霉素、100 μg／ml鏈霉素及2 mmol／L谷氨酰胺的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基中，于37℃、5% CO2全濕度培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞貼壁達(dá)80%～90%時，按5×105／ml的細(xì)胞密度接種于6孔板中。

1.3 瞬時轉(zhuǎn)染取對數(shù)生長期A549細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染實驗。轉(zhuǎn)染前1 d，將A549細(xì)胞計數(shù)后，接種于24孔板，用無血清不含抗生素的RPMI1640培養(yǎng)液稀釋待轉(zhuǎn)染。成熟miR-21抑制物、模擬物和其陰性對照由美國Biomic生物技術(shù)公司設(shè)計并合成。引物序列如下：miR-21模擬物正義鏈（sense）：5′-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3′，反義鏈（antisense）：5′-AACAUCAGUCUGAUAAGCUAUU-3′，miR-21抑制物序列（sequences）：5′-UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3′。將miR-21抑制物、模擬物和陰性對照與脂質(zhì)體LipofectamineTM2000 Reagent混勻，室溫靜置20 min后，加入相應(yīng)各孔細(xì)胞中，于37℃、5%CO2保溫箱孵育4～6 h，更換含血清RPMI1640，24 h和48 h后提取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的總RNA和總蛋白。

1.4 MTT比色法檢測細(xì)胞增殖設(shè)計分組：轉(zhuǎn)染miR-21抑制物組、轉(zhuǎn)染miR-21模擬物和陰性對照組。將處于對數(shù)生長期的各實驗組A549細(xì)胞胰蛋白酶消化后，用完全培養(yǎng)基重懸形成細(xì)胞懸液。用血球計數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。鋪板細(xì)胞密度為1 500個／孔鋪于96孔板中，每組5個復(fù)孔，每孔100 μl，共5張96孔板，連續(xù)監(jiān)測5 d，鋪板過程中要確保每孔加入細(xì)胞數(shù)一致。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。從鋪板后第2天開始，培養(yǎng)終止前4 h，每孔加入10 μl MTT（5 g／L），無需換液，4 h后，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入100 μl DMSO終止反應(yīng)，振蕩器震蕩5～10 min使結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀490 nm處測定吸光度（absorbance，A）值。

1.5 細(xì)胞蛋白質(zhì)提取取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，加入蛋白裂解液400 μl，按1 ml裂解液加10 μl PMSF原則加入PMSF，混勻，在搖床上冰浴30 min。裂解完后，然后轉(zhuǎn)移裂解液至離心管中，4℃、12 000 r／min離心15 min，取上清液分裝轉(zhuǎn)移至新的離心管中。

1.6 細(xì)胞RNA提取取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，加入Trizol 1 ml后充分混勻；加入氯仿0.2 ml，充分混勻，室溫下孵育10 min，4℃、12 000 r／min離心15 min，取上清液至EP管；加入等體積異丙醇，-20℃助沉30 min，4℃、12 000 r／min離心10 min，棄上清液；75%乙醇（含DEPC水）洗滌沉淀1次，4℃、12 000 r／min離心5 min，棄乙醇層；真空干燥5～10 min，加DEPC水振蕩溶解RNA沉淀，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 Western blot法檢測Smad7的表達(dá)將提取的細(xì)胞蛋白定量，然后通過SDS-PAGE電泳分離，PVDF轉(zhuǎn)膜后封閉3 h，加入Smad7和β-actin一抗孵育過夜，然后加Smad7和β-actin二抗孵育1 h后，化學(xué)發(fā)光法顯示蛋白條帶，膠片顯影、定影。成像結(jié)果采用Quantity One V 4.6軟件分析，測定主帶的灰度值以計算Smad7蛋白表達(dá)水平，結(jié)果重復(fù)3次。

1.8 qRT-PCR法檢測Smad7的表達(dá)采用TRIzol法提取各組細(xì)胞總RNA。反轉(zhuǎn)錄成cDNA并進(jìn)行熒光定量PCR。選用β-actin為內(nèi)參基因。每個反應(yīng)設(shè)3個復(fù)管，反應(yīng)結(jié)束后，熒光定量PCR儀自動分析各管的循環(huán)閾值（threshold cvcle，Ct）。采用2-ΔCt法計算各組組織中目的基因的相對表達(dá)量，采用2-ΔΔCt法計算實驗組目的基因表達(dá)相對于對照組表達(dá)的倍數(shù)。各組ΔCt值：Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt＝ΔCt實驗組-ΔCt對照組。引物序列：Smad7上游引物：5′-GAGGATGGAACTTTGGGTCTC-3′，下游引物：5′-TCATTTCCTTGATTAGGGTGGT-3′；β-actin上游引物：5′-GCTCGTCGTCGACAACGGCTC-3′，下游引物：5′-CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC-3′。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)均以表示，組間比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 瞬時轉(zhuǎn)染miR-21抑制物和模擬物后miR-21表達(dá)變化瞬時轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞miR-21抑制物和模擬物48 h后，miR-21抑制物組miR-21表達(dá)明顯低于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝28.13，P＜0.05）；miR-21模擬物組miR-21表達(dá)明顯高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝20.85，P＜0.05）。見圖1。

2.2 瞬時轉(zhuǎn)染miR-21抑制物和模擬物對Smad7mRNA表達(dá)的影響瞬時轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞miR-21抑制物和模擬物48 h后，miR-21抑制物組Smad7 mRNA表達(dá)明顯高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝30.06，P＜0.05）；miR-21模擬物組Smad7 mRNA表達(dá)明顯低于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝29.35，P＜0.05）。見圖2。

2.3 瞬時轉(zhuǎn)染miR-21抑制物和模擬物對Smad7蛋白表達(dá)的影響瞬時轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞miR-21抑制物和模擬物48 h后，miR-21抑制物組Smad7蛋白表達(dá)明顯高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝22.35，P＜0.05）；miR-21模擬物組Smad7蛋白表達(dá)明顯低于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝20.89，P＜0.05）。見圖3。

2.4 MTT實驗結(jié)果顯示瞬時轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞miR-21抑制物和模擬物48 h后，miR-21抑制物組細(xì)胞增殖活性明顯低于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝18.68，P＜0.05）；miR-21模擬物組細(xì)胞增殖活性明顯高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝17.54，P＜0.05）。見圖4。

3 討論

研究［6］證實miR具有調(diào)節(jié)包括細(xì)胞分化、增殖、凋亡或壞死以及發(fā)育等多種生物生命活動過程的作用。研究［7］顯示，多種miR在肺癌組織中存在異常表達(dá)，與肺癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。miR不但可以作為腫瘤的早期診斷指標(biāo)，還可以作為腫瘤治療的潛在靶點。文獻(xiàn)［8］報道已證實，miR-21在肺癌中高表達(dá)，但具體機(jī)制尚不十分清楚。

文獻(xiàn)［9］報道，Smad7在耐順鉑肺癌A549細(xì)胞株中表達(dá)降低。此外，生物信息學(xué)提示，Smad7是miR-21潛在作用靶基因［10］。本研究將miR-21模擬物和抑制物轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，通過qRT-PCR法分析顯示，轉(zhuǎn)染后miR-21模擬物細(xì)胞中miR-21的表達(dá)明顯增加；轉(zhuǎn)染后miR-21抑制物細(xì)胞中miR-21的表達(dá)明顯降低；瞬時轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞miR-21抑制物和模擬物后，miR-21抑制物組Smad7 mRNA和蛋白表達(dá)明顯高于陰性對照組；miR-21模擬物組Smad7 mRNA和蛋白表達(dá)明顯低于陰性對照組。

通過MTT實驗顯示轉(zhuǎn)染miR-21模擬物的細(xì)胞較轉(zhuǎn)染陰性對照組的細(xì)胞A490nm值明顯增加，同時，轉(zhuǎn)染miR-21抑制物的細(xì)胞較轉(zhuǎn)染陰性對照組的細(xì)胞A490nm值明顯降低，提示miR-21模擬物促進(jìn)A549細(xì)胞的增殖，而miR-21抑制物抑制A549細(xì)胞的增殖。以上結(jié)果提示miR-21抑制物抑制A549細(xì)胞的增殖可能是通過促進(jìn)Smad7表達(dá)引起的；而miR-21模擬物促進(jìn)A549細(xì)胞的增殖可能是通過減少Smad7表達(dá)引起的。

綜上所述，miR-21通過對肺癌細(xì)胞中Smad7表達(dá)的靶向調(diào)控，進(jìn)而影響肺癌A549細(xì)胞活化增殖，提示miR-21是肺癌A549細(xì)胞活化增殖的潛在的靶向分子，可以為干預(yù)和預(yù)防肺癌提供新思路。

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Influence of miR-21 control Smad7 expression and lung cancer A549 cell line proliferation

Li Bin，Pan Yueyin，Du Yingying
（Dept of Oncology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo explore miR-21 regulation of Smad7 in lung cancer A549 cell line as well as its impact on the proliferation of lung cancer A549 cell line.MethodsmiR-21 mimic and inhibitors in lung cancer A549 cell line were transfected by using Lipofectamine 2000 Reagent.After 48 h，Western blot and qRT-PCR were applied to assess the expression of protein and mRNA of Smad7.MTT assay was used to determine the proliferation influence of the transfected lung cancer A549 cell line.ResultsWestern blot and qRT-PCR showed that A549 cell transfected miR-21 mimic exhibited down-regulated Smad7 protein and mRNA expression，and A549 cell transfected miR-21 inhibitor exhibited up-regulated Smad7 protein and mRNA expression.The A549 cell proliferation activity decreased significantly after transfected miR-21 inhibitors.ConclusionmiR-21 inhibitors can increase Smad7 protein and mRNA expression，and suppress the proliferation activity of lung cancer A549 cell significantly.

lung cancer；microRNA-21；Smad7；proliferation

R 73.3

A

1000-1492（2015）12-1766-04

時間：2015-11-18 10：12：34

http：／／www.cnki.net／KCMS／detail／34.1065.R.20151118.1012.026.html

2015-09-08接收

安徽省科技攻關(guān)項目（編號：1301042214）；安徽省2012年度科研計劃項目（編號：12070403072）；安徽省高校省級自然科學(xué)基金重點項目（編號：KJ2012A157）

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院干部腫瘤科，合肥 230022

李 斌，男，碩士研究生；

潘躍銀，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：yueyinpan＠gmail.com