糖腎寧對自發性2型糖尿病KK-Ay小鼠腎組織MMP-9、TIMP-1表達的影響

鄒大威 高彥彬 劉迎新 耿建國 彭麒朕 龔慕辛 朱智耀 李嬌陽楊鑫偉 王曉磊

·論著·

糖腎寧對自發性2型糖尿病KK-Ay小鼠腎組織MMP-9、TIMP-1表達的影響

鄒大威 高彥彬 劉迎新 耿建國 彭麒朕 龔慕辛 朱智耀 李嬌陽楊鑫偉 王曉磊

目的 觀察糖腎寧對自發性2型糖尿病KK-Ay小鼠腎功能及腎組織降解酶系基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)、基質金屬蛋白酶組織抑制劑-1(tissue inhibitor of metalloproteinase 1,TIMP-1)蛋白及基因表達的影響。方法 采用自發性2型糖尿病KK-Ay小鼠建立糖尿病腎病模型,隨機分為模型組、纈沙坦組和糖腎寧組各20只,設立C57BL/6J小鼠20只為空白組;予通心絡及纈沙坦干預12周后,測定各組小鼠血清尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、血清肌酐(serum creatinine,SCr),采用Western Blot、Realtime-PCR、免疫組化方法檢測MMP-9、TIMP-1蛋白表達或定位及基因表達水平。結果 與空白組比較,模型組小鼠BUN、SCr均明顯升高(P＜0.05);腎組織TIMP-1蛋白及基因表達明顯升高、MMP-9蛋白及基因表達明顯降低(P＜0.05);與模型組比較,糖腎寧組和纈沙坦組BUN、SCr均明顯降低(P＜0.05),腎組織TIMP-1蛋白及基因表達明顯降低、MMP-9蛋白及基因表達明顯升高(P＜0.05)。結論 糖腎寧能夠保護自發性2型糖尿病KK-Ay小鼠腎功能、延緩糖尿病腎病腎纖維化進展,調控糖尿病腎病腎組織降解酶系可能是糖腎寧防治糖尿病腎病的作用機制之一。

糖尿病腎病; 糖腎寧; KK-Ay小鼠; 基質金屬蛋白酶-9; 基質金屬蛋白酶組織抑制劑-1

最近的研究報告表明中國成人糖尿病的發病率約為11.6%,約1.139億人;糖尿病前期的發病率約為 50.1%,約 4.934億人[1]。糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最主要的微血管并發癥,也是糖尿病患者致死致殘的主要原因。目前認為DN的主要發病機制是糖代謝紊亂、糖基化終末產物增多,氧化應激等因素導致相應靶基因的轉錄、靶蛋白的表達異常進而引起的腎纖維化,主要表現為細胞外基質(extracellular matrix,ECM)增生[2]?；|金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)和基質金屬蛋白酶組織抑制劑-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)是基質金屬蛋白酶系的重要成員,在腎組織細胞外ECM合成和分解中起著重要的作用,若DN條件下腎組織二者表達失衡,則會導致進行性的腎纖維化[3]。本課題采用自發性2型糖尿病KK-Ay小鼠建立DN模型,探討糖腎寧是否通過調節腎組織降解酶系TIMP-1、MMP-9,抑制細胞外基質沉積,保護腎功能、達到防治糖尿病腎病的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8周齡SPF級雄性KK-Ay小鼠60只,8周齡SPF級雄性 C57BL/6J小鼠20只,動物合格證號SCXK(京)2014-0004,均購自北京華阜康生物科技股份有限公司。

1.2 干預藥物與試劑

糖腎寧(配比:黃芪4份、葛根2份、川芎2份、大黃1份、金櫻子2份、倒扣草3份),由首都醫科大學中醫藥學院制劑室制備成浸膏粉[4],纈沙坦膠囊(規格:80 mg/粒,lot.:X1448,北京諾華制藥有限公司)。

MMP-9抗體(Abcam,ab38898,WB用),TIMP-1抗體 (R&D,AF980),MMP-9抗體 (Abcam, ab137867,免疫組化用);TRIzol總RNA提取試劑[DP405-02,天根生化科技(北京)有限公司];肌酐測定試劑盒(lot.:143011,中生北控生物科技股份有限公司);尿素測定試劑盒(lot.:141141,中生北控生物科技股份有限公司)。兔超敏二步法檢測試劑盒(PV-9001,lot.:K155222C,中杉金橋);山羊超敏二步法檢測試劑盒(PV-9003,lot.:K145620B,中杉金橋)。

1.3 儀器

半自動生化儀(URIT-810,桂林優利特醫療電子有限公司,中國);電泳儀(DG-300C,北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司,中國);熒光定量PCR儀(ABI7500,Applied Biosystems);旋渦混合儀(XW-80A,海門市其林貝爾儀器制造有限公司);生物顯微鏡(ECLIPSE 80i,Nikon,日本)。

1.4 實驗方案

本實驗采用自發性2型糖尿病KK-Ay小鼠建立糖尿病腎病模型,C57BL/6J小鼠作為空白對照組小鼠,實驗全程KK-Ay小鼠予以高脂飼料飲食誘發糖尿病腎病,C57BL/6J小鼠予以普通飼料喂養。8周齡KK-Ay小鼠予以高脂飼料飼養4周后,測定24小時尿白蛋白排泄率(urinary albumin excretion rate, UAER),與空白對照組C57BL/6J小鼠相比,24小時UAER明顯升高且血糖≥16.7 mmol/L視為糖尿病腎病模型建立成功。造模成功的KK-Ay小鼠隨機分為模型組20只(等量蒸餾水灌胃),纈沙坦組20只(10 mg/kg·d灌胃),糖腎寧組20只(生藥20 g/kg·d灌胃);空白對照組20只(等量蒸餾水灌胃),實驗期間自由進食飲水,連續給藥12周。

1.5 標本收集及指標檢測

給藥12周末,各組小鼠禁食12小時于次日清晨處理。根據小鼠體質量,用5%水合氯醛麻醉(0.1 mL/10 g),摘眼球取血,分離血清4℃保存待測,采用苦味酸法測定血清肌酐,采用酶偶聯速率法測定血清尿素氮。取腎臟縱切,一半用于10%多聚甲醛固定、石臘包埋,用于后續Masson染色和免疫組化檢測,一半用預冷的生理鹽水洗去血漬和雜質,取腎皮質迅速放入液氮中保存,Western Blot方法檢測腎組織中MMP-9及TIMP-1蛋白表達水平, Realtime-PCR方法檢測腎組織中MMP-9及TIMP-1 mRNA表達水平。

1.6 Western blot

將腎組織用滅菌的預冷的眼科剪刀分離,迅速放入勻漿器中勻漿,超聲粉碎,4℃離心后取上清, BCA法蛋白定量。每個樣品取相同總蛋白含量在10%SDS-PAGE膠上電泳分離,之后轉印至硝酸纖維素膜(XLL092-2,PALL)。用5%脫脂奶粉封閉振蕩,一抗4℃孵育過夜,TBST搖床洗膜5分鐘×3次,二抗孵育,TBST搖床洗膜5分鐘×3次,ECL試劑暗室內膠片曝光,掃描膠片,用圖像分析軟件分析目標條帶。

1.7 實時定量熒光PCR(Realitime-PCR)

采用TRIzol總RNA提取試劑進行樣本RNA提取,采用 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser進行cDNA反轉錄,用ABI 7500型熒光定量PCR儀進行擴增,實驗操作按產品說明書進行,采用2-△△CT法進行數據的相對定量分析。以下引物均在北京Invitrogen公司合成,具體如下:

1.8 免疫組化

按照常規免疫組化步驟進行,制作石蠟切片,厚度4μm,微波爐內進行抗原修復,滴入3%H2O2滅活,10%血清封閉,加入一抗,4℃冰箱孵育一晚,烘箱37℃復溫60分鐘,0.01M PBS漂洗三次,滴入適當二抗,烘箱37℃孵育,PBS漂洗三次,DAB染色,鏡下控制反應時間,蘇木素輕度復染,脫水,透明,封片,光學顯微鏡觀察。

1.9 統計方法

采用 SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA),數據以均值±標準差(±s)表示,統計數據符合正態分態且方差齊,多重比較均采用LSD檢驗,以P＜0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 糖腎寧對腎功能的影響

24周齡時,與空白組(CTL)相比,模型組(M)小鼠的BUN、SCr明顯升高(P＜0.05);與模型組相比,纈沙坦(XST)、糖腎寧組(TSN)小鼠的BUN、SCr均有不同程度的降低(P＜0.05),各干預組組間比較無顯著差異(P＞0.05)。實驗結果表明糖腎寧具有明顯的保護腎功能的作用。見表2。

表2 各組小鼠24周齡BUN、SCr的比較(±s)

注:與空白組比較,aP＜0.05;與模型組比較,bP＜0.05

組別 n BUN(mmol/L) SCr(umol/L) CTL 12 9.32±2.54 18.70±1.66 M 12 13.42±1.95a27.28±2.31aXST 12 10.95±1.69b23.69±2.03bTSN 12 10.68±1.65b24.14±2.50b

2.2 糖腎寧對糖尿病小鼠腎組織纖維化的影響

本實驗采用Masson染色觀察糖腎寧對糖尿病小鼠腎組織纖維化的影響,Masson染色是觀察顯示組織中纖維的一種特殊染色方法,如圖所示綠染區為纖維成分,主要沉積在腎小球系膜區及腎間質?？瞻捉M:腎組織形態大致正常,腎小管排列整齊,膠原沉積較少。模型組:腎小球肥大,腎小管形態結構較模糊,呈空泡樣病變,腎小球系膜區及腎間質膠原沉積較多。糖腎寧組及西藥組較模型組的腎纖維化程度有所減輕。見圖1。

2.3 Western Blot方法檢測糖腎寧對MMP-9、TIMP-1蛋白表達的影響

與空白對照組相比,模型組腎組織MMP-9蛋白表達明顯降低(P＜0.05);與模型組相比,糖腎寧及纈沙坦組腎組織MMP-9蛋白表達明顯升高(P＜0.05)。與空白對照組相比,模型組腎組織TIMP-1表達明顯升高(P＜0.05);與模型組相比,糖腎寧及纈沙坦組腎組織TIMP-1蛋白表達明顯降低(P＜0.05)。見圖2、表3。

表3 各組小鼠腎組織中MMP-9、TIMP-1的蛋白表達比較(±s)

注:與空白組比較,aP＜0.05;與模型組比較,bP＜0.05

組別 n MMP-9/β-actin TIMP-1/β-actin CTL 4 1.98±0.14 1.29±0.16 M 4 1.16±0.10a2.95±0.14aXST 4 1.43±0.16b2.05±0.21bTSN 4 1.39±0.08b1.79±0.23b

2.4 Realtime-PCR方法檢測糖腎寧對 MMP-9、TIMP-1基因mRNA轉錄水平的影響

與空白對照組相比,模型組腎組織 MMP-9 mRNA表達明顯降低(P＜0.05);與模型組相比,糖腎寧及纈沙坦組腎組織MMP-9 mRNA表達明顯升高(P＜0.05)。與空白對照組相比,模型組腎組織TIMP-1 mRNA表達明顯升高(P＜0.05);與模型組相比,糖腎寧及纈沙坦組腎組織TIMP-1 mRNA表達明顯降低(P＜0.05)。見表4。

表4 各組小鼠腎組織中MMP-9、TIMP-1mRNA表達的比較(±s)

注:與空白組比較,aP＜0.05;與模型組比較,bP＜0.05

組別 n MMP-9 mRNA TIMP-1 mRNA CTL 5 1.05±0.05 1.03±0.04 M 5 0.21±0.05a4.33±0.26aXST 5 0.64±0.02b2.89±0.10bTSN 5 0.69±0.03b2.77±0.17b

2.5 免疫組化方法檢測糖腎寧對MMP-9、TIMP-1蛋白表達的影響

如圖所示,棕黃色為MMP-9、TIMP-1陽性染色區,主要表達在腎小球,系膜區及腎小管?？瞻捉MC57小鼠MMP-9表達較多,TIMP-1表達較少,模型組KK-Ay小鼠MMP-9表達較少、TIMP-1表達較多,經糖腎寧及纈沙坦治療后有所改善。這與Western blot及Realtime-PCR檢測MMP-9、TIMP-1蛋白和基因表達各組趨勢是一致的。見圖3、4。

3 討論

目前2型糖尿病腎病的建立,應用較為廣泛的是高糖高脂飲食加小劑量鏈脲佐菌素(streptozocin, STZ)注射誘導2型DN動物模型的建立,但不同動物個體對STZ注射后胰腺損傷也具有個體差異,為疾病研究的準確性帶來了干擾[5]。本實驗的KK-Ay小鼠模型是在KK小鼠的基礎上轉入黃色肥胖基因(Ay)而成,遺傳背景清楚,血糖在小鼠16周齡達到中高水平,持續穩定,符合2型糖尿病動物模型的特點,且非常接近人類DN的臨床表型[6]。本實驗結果表明12周齡KK-Ay小鼠的尿白蛋白及血糖均符合糖尿病腎病的成模標準,說明模型建立成功。糖腎寧給藥12周后具有明顯的降低血清肌酐、尿素氮的作用,提示糖腎寧能夠保護2型糖尿病腎病KK-Ay小鼠腎功能。

目前普遍認為糖尿病腎病是糖代謝紊亂,血流動力學異常,氧化應激,細胞因子多種因素綜合作用的結果[7]。其主要的病理特征是ECM在腎小球及腎間質的沉積,最終導致腎小球硬化及腎間質纖維化,因此ECM降解系統與糖尿病腎病密切相關。MMPS/TIMPS是參與ECM降解過程的重要酶系,其中MMP-9為相對分子質量為92000的明膠酶,是腎臟表達的基質金屬蛋白酶家族的主要成員,可降解多種ECM組分(Ⅳ型膠原、Ⅴ型膠原、Ⅵ型膠原及纖維連接蛋白等)。TIMP-1是體內存在和作用最廣泛的一種TIMPs,在腎臟主要表達于腎小球系膜細胞、內皮細胞、上皮細胞,是MMP-9的特異性抑制物[8]。高糖條件下,腎臟固有細胞及間質細胞合成的多種細胞因子及生長因子自分泌及旁分泌的方式發揮其作用,最終導致系膜細胞增殖,細胞外基質增生,導致DN的發生。而細胞因子(如結締組織生長因子)可通過影響腎臟MMP-9及TIMP-1的表達和活化,引起MMP-9表達下降,TIMP-1表達升高,導致ECM合成及降解失衡[9-10]。研究表明糖尿病大鼠模型的MMP-9的蛋白表達水平隨著DN進展明顯下調[11]。

本研究結果顯示,與空白對照組相比,模型組小鼠腎組織 MMP-9蛋白及基因表達明顯降低, TIMP-1蛋白及基因表達明顯升高,DN小鼠腎組織ECM降解酶系MMP-9/TIMP-1失衡,勢必導致ECM沉積增加,Masson染色顯示腎小球系膜區及腎間質膠原沉積較多。經糖腎寧治療后DN小鼠腎組織MMP-9/TIMP-1失衡有所改善,腎臟病理亦有明顯改善。提示糖腎寧能夠通過調控ECM降解酶系MMP-9/TIMP-1,抑制DN小鼠腎組織腎纖維化,延緩DN進展。

本研究團隊認為糖尿病腎病日久出現的腎系并發癥,病位在腎,繼發于消渴病,因此稱為消渴病腎病[12]。糖尿病腎病的基本病理改變是腎之絡脈結構損傷,導致腎功能失常,糖腎寧是在通絡原則指導下結合老師多年臨床經驗創立的方劑,主要由黃芪、金櫻子、川芎、大黃等組成,方中黃芪益氣扶正,金櫻子固精縮尿,大黃逐瘀清熱降濁,川芎活血化瘀通絡。前期臨床研究[13]表明糖腎寧可明顯降低DN患者尿白蛋白、保護腎功能,安全有效。中藥藥理研究表明黃芪通過免疫調節、降低尿蛋白、調節血糖血脂、改善腎臟血流動力學異常及抗纖維化等作用共同參與了腎臟保護機制[14];金櫻子具有抗氧化、增強免疫力及保護腎臟等作用[15];大黃具有保護腎功能的作用[16];川芎能夠抑制腎細胞凋亡,保護腎臟[17]。

本實驗研究結果提示中藥復方糖腎寧具有防治糖尿病腎病,保護腎功能的作用,其機制與通過調控ECM降解酶系MMP-9/TIMP-1蛋白及基因表達,減少腎組織ECM沉積,抑制腎纖維化有關,但是否通過其他機制防治糖尿病腎病的進展尚需進一步的研究。

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Effects of Tangshenning on MMP-9、TIMP-1 expression of renal tissue in type 2 diabetic KK-aym ice

ZOU Da-wei,GAO Yan-bin,LIU Ying-xin,et al. Capital Medical University School of Traditional Chinese Medicine& Beijing Key Laboratory of TCM Collateral Disease Theory Research,Beijing 100069,China

GAO Yan-bin,E-mail:dfyynfm@163.com

Objective To explore effects of Tangshenning on expression of matrix metalloproteinase-9(MMP-9)、tissue inhibitor of metalloproteinase 1(TIMP-1)in diabetic nephropathy micemodel.M ethods Diabetic male KK-Ay mice were randomLy divided into three groups:themodel group(n=20),the valsartan group(n=20)and the Tangshenning group(n=20).Male C57BL/6J (n=20)mice were designed as the control group.After intervention with Tangshenning and valsartan for12 weeks,serum creatinine(Scr)and serum urea nitrogen(BUN)were examined.Expression of MMP-9, TIMP-1 were accessed by Realtime-Pcr,Western Blot and Immunohistochemistry.Results Comparedwith control group,BUN and SCr were significantly increased(P＜0.05),while them ofmice in valsartan and tangshenning group were decreased compared withmodel group(P＜0.05).Compared with the control group,the protein and gene expression ofMMP9 and TIMP-1 both have the same trend inmodel group,the expression of MMP9 were decreased significantly and the expression of TIMP-1 were increased significantly (P＜0.05).Through the treatment of Tangshenning and valsartan for 12 weeks,the expression of TIMP-1 were down-regulated and the expression of MMP-9 were up-regulated in diabeticKK-Ay mice(P＜0.05). Conclusion Tangshenning could protect renal function and delay the process of renal fibrosis partly through regulating extracellularmatrix degradation enzymes MMP-9/TIMP-1 expression.

Diabetic nephropathy; Tangshenning; KK-Aymice; Matrixmetalloproteinase-9; Tissue inhibitor ofmetalloproteinase 1

R285

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2015.11.013

2015-08-15)

(本文編輯:蒲曉田)

國家自然科學基金青年科學基金(81302951);國家重點基礎研究發展計劃(973計劃) (2012CB518602)

100069 北京,首都醫科大學中醫藥學院[鄒大威、高彥彬、劉迎新(碩士研究生)、耿建國、彭麒朕(碩士研究生)、龔慕辛、朱智耀、李嬌陽(碩士研究生)、楊鑫偉(博士研究生)、王曉磊(碩士研究生)];中醫絡病研究北京市重點實驗室(鄒大威、高彥彬、劉迎新、耿建國、彭麒朕、朱智耀、李嬌陽、楊鑫偉、王曉磊)

鄒大威(1982-),女,博士,講師,主治醫師。研究方向:中醫藥防治糖尿病研究。E-mail: taotaosweety@163.com

高彥彬(1960-),博士,教授,主任醫師,博士生導師。研究方向:中醫藥防治糖尿病研究。E-mail: dfyynfm@163.com