制備角膜新生血管動物模型的研究進展

王淑榮,田舒慈,劉 鑫,何宇茜,李 瑩,蘇冠方,張 妍

制備角膜新生血管動物模型的研究進展

王淑榮1,田舒慈2,劉 鑫1,何宇茜1,李 瑩1,蘇冠方1,張 妍1

結膜中的血管過度生長并延伸入角膜形成角膜新生血管(corneal neovascularization,CNV)。血管的異常增生通常來源于角膜受損及自我修復,這是新生血管形成的重要過程。血管的病理性增生阻礙光在眼球內的傳播,促進瘢痕形成并引起炎癥反應。角膜新生血管會嚴重影響視力,甚至導致失明。新生血管性眼病是臨床上最常見的問題之一。因此進一步的角膜新生血管機制研究是防治新生血管性眼病的關鍵。角膜新生血管動物模型的選擇對研究具有重要意義。本文主要就幾種角膜新生血管模型的制備方法作一綜述。

角膜;新生血管;模型;制備

0 引言

血管生成是自然生理過程,根據發生部位和時間的不同,血管形成對機體產生的的影響不同。在人體大多數組織中,它參與組織細胞的生長和受損組織的修復。生理狀態下,毛細血管網僅圍繞角膜緣生長,不會延伸至角膜,角膜保持透明狀態。在炎癥、外傷、手術等不良狀態下,毛細血管會侵入角膜,產生病理性CNV。其病理過程主要與作用于血管的細胞因子有關:作用于血管的細胞因子在血管形成過程中起著關鍵的調控作用,包括血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF),堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF),血小板活化因子(platelet activating factor, PAF)等促進因子和基質金屬蛋白(matrix metalloproteinases,MMPs),白細胞介素(IL-1)等抑制因子。血管形成過程受到許多促進因子和抑制因子的調控。在正常的生理狀態下,抑制因子占優勢,兩種因子的濃度會達到平衡以角膜保持生理狀態。當濃度平衡被打破時,促血管生長的細胞因子會促進血管內皮細胞侵入角膜,形成毛細血管[1]。

作用于血管的細胞因子的過表達與下列因素有關[2-3]:(1)角膜水腫:角膜水腫時,角膜組織間壓力減小,血管容易長入[4]。(2)炎性反應:炎細胞的浸潤導致細胞碎片形成,這些細胞碎片在新生的血管周圍可見,對血管生成有促進作用[4]。(3)缺氧:缺氧條件可刺激促血管生成的細胞因子大量表達。(4)角膜神經纖維分布:新的研究發現,角膜感覺神經與新生血管形成是互相抑制的。角膜新生血管形成與神經的損傷也可能存在聯系[5]。

角膜新生血管動物模型是通過手術、物理、化學、生物等方法,人為誘發動物角膜新生血管增生,產生類似于人類疾病的模型,是誘發性疾病動物模型。CNV模型需要具備以下特點:(1)制作簡便,模型穩定;(2)實驗條件

引用:王淑榮,田舒慈,劉鑫,等.制備角膜新生血管動物模型的研究進展.國際眼科雜志2015;15(11):1892-1895和操作簡單,血管形成規則;(3)個體間差異較小;(4)其他條件容易控制。實驗中應當遵守研究用動物的Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO)決議[6]。現以家兔為實驗模型,從造模方法、效果、原理、優劣幾方面對幾種CNV的動物模型制備方法作介紹。

1 誘導炎癥性CNV模型

1.1 物理方法誘導的CNV模型

1.1.1 角膜縫線法造模方法:家兔全身麻醉和眼表麻醉,顯微鏡下用開瞼器置開眼瞼,在距角鞏膜緣1.0mm處進針,穿過角膜半厚度,經過3mm寬出針,正反兩方向打結后剪掉線頭[7]。術后為預防感染,眼表滴抗生素眼液。效果:縫線后3～8d可見毛細血管芽由角膜緣長入, 14～18d血管生長達到高峰。新生血管在僅縫線兩側呈刷狀生長,未涉及角膜整個圓周。原理:此模型主要通過角膜損傷所致炎癥反應誘導新生血管。基質內縫線埋入引起了角膜縫線部位局部水腫,炎癥細胞侵入[8],此外,角膜縫線還會導致角膜上皮、基底細胞損傷而導致炎癥反應。一方面,炎癥反應中炎細胞會分泌促血管生長的細胞因子,促進血管生成;另一方面,角膜損傷造成的角膜微環境缺氧也會促進VEGF等促血管生成細胞因子的表達,從而促進血管生成[9]。優點:縫線法誘導新生血管的方法成本低、所需實驗器材簡單、操作過程簡單、新生血管生長比較規則、而且避免了化學誘導方法中一些化學試劑的影響[10]。缺點:縫線成功與否受術者技巧影響較大,若縫線位于角膜基質層較深處,容易導致角膜穿孔,若縫線稍淺則容易脫線致使模型失敗[10]。應用現狀:由于此模型簡單易行,成本低廉,被廣泛應用于新生血管的相關研究中。

1.1.2 熱灼傷法目前國內外關于角膜熱灼傷后繼發新生血管的動物模型的研究報道較少,角膜熱燒傷后新生血管的基礎研究并不深入。現今研究者多利用恒溫灼傷器進行角膜熱灼傷。造模方法[11]:設定燒灼器達到預定溫度。家兔進行全身麻醉和眼表麻醉。顯微鏡下用開瞼器開瞼,用棉簽拭去角膜表面液體干燥角膜,探頭凹面貼緊角膜中央區域燒灼,燒灼5s后離開,立即用大量生理鹽水沖洗角膜。術后為預防感染,眼表滴抗生素眼液。效果[11]:燒灼術后第5～8d,可見毛細血管從角鞏膜緣長入;在第14d左右,新生血管生長達到高峰。原理:熱灼傷主要是通過引起角膜炎癥反應來誘發CNV。Cooper等[12]認為:前列腺素在血管生成過程中也發揮重要作用。角膜損傷后前列腺素高表達,啟動并維持促血管生長因子,促進新生血管增殖。優點:此模型建立簡單易行,所需儀器不復雜,對角膜損傷較小。缺點:此方法灼傷力度難以控制,力度過大而容易致角膜穿孔,形成瘢痕導致造模失敗。應用現狀:此模并不常用。國內此方面報道較少。

1.2 化學方法誘導的CNV模型化學燒傷法:此方法利用堿性化學藥物與直接角膜表面接觸,導致角膜損傷,誘發新生血管形成。氫氧化鈉是實驗研究中最常用的化學藥物。造模方法[13]:家兔全身麻醉和眼表麻醉。將直徑為5mm濾紙片在1.0mol/L氫氧化鈉浸泡過后放置在距離角膜緣1.5mm的角膜表面約30s,之后立即移除濾紙片,用大量生理鹽水沖洗眼球2min。術后為預防感染,眼表滴抗生素眼液。此外,郭立云等[14]經實驗發現,bFGF和堿燒傷聯合應用誘導新生血管,既可以增加并且維持角膜新生血管,又降低了燒傷的強度,一定程度上降低了溶解、脫出等并發癥發生的風險,提高了模型制作的成功率。效果:術后第3d,可見兔角鞏膜緣處毛細血管網擴張,毛細血管芽呈刷狀快速生長,延伸深入角膜。第7d,新生血管達到生長高峰。原理:堿性物質主要是通過引起角膜炎癥反應來誘發新生血管,浸潤的炎細胞可以表達VEGF,促進新生血管形成。堿進入細胞后可引起細胞膜結構的破壞和眼部血栓形成,組織缺血缺氧。新生血管形成的免疫機制在近年來被廣泛認可:堿性物質進入細胞會破壞細胞結構使角膜蛋白變性成為抗原而刺激機體液免疫反應。創傷角膜還會刺激組織產生血小板活化因子(platelet activating factor,PAF)等趨化性細胞因子,引起多核中性粒白細胞趨化進入角膜,淋巴因子如TNF-α等表達也參與引發并維持角膜炎癥反應[15]。優點:此模型很好地模擬了臨床上人角膜堿燒傷疾病的病理過程。而且此模型一般不會引起角膜穿孔,不會影響新生血管的測定,角膜組織可以更好的保存,有利于免疫熒光中著色,而且此造模方法成本低,操作容易[16]。應用現狀:堿燒傷法誘導角膜新生血管是最常用的造模方法,廣泛應用于角膜新生血管的相關研究。

2 角膜層間植入誘導劑模型

角膜層間植入誘導劑模型多用于鑒定血管形成過程中的刺激因子,或用于研究血管生成或抑制劑,新生血管可以量化[17]。建立的基本方法為:手術做一角膜切口,將含有能夠刺激血管增殖的誘導劑埋置于角膜層間以誘導CNV形成。常用誘導劑有VEGF,bFGF,白細胞介素-1(IL-1),內毒素,二氧化硅等。

2.1 VEGF緩釋藥丸誘導法造模方法[18]:制備VEGF緩釋藥丸:準備可溶于任何緩沖溶液的同型VEGF165 (165個氨基酸)的聚合物,每粒包含5μg。VEGF因子的植入和緩釋需要VEGF保持在半固體狀態。準備VEGF和其它實驗用品。利用硫糖鋁制備VEGF緩釋藥丸,每粒包含大約100ng或200ngVEGF。無菌條件下將VEGF緩釋藥丸植入角膜層間。效果[19]:24h后角膜出現輕微水腫。植入200ngVEGF的角膜術后2d出現邊緣血管擴張。第3d,邊緣血管延伸入角膜,在之后2d內,新生血管延伸至藥丸處,第6d新生血管侵占藥丸。第7d,血管生長趨于穩定。植入較小劑量VEGF(100ng)的新生血管反應程度較小。此外,自第7d起在植入200ng角膜中出現輕微間質水腫和組織出血現象,但是這種現象并沒有出現在小劑量VEGF處理的角膜。原理:VEGF是一種多肽細胞因子,是調控CNV形成的最重要因子,是血管形成的“調控中心”[19]。有研究表明,VEGF通過作用于以下幾個步驟促進血管生成:原始血管中蛋白質的水解,內皮細胞的增殖和遷移,毛細血管的形成[18]。VEGF可以直接作用于內皮細胞,與血管內皮細胞上的特異性受體結合而激活細胞內酪氨酸激酶和下游細胞的信號級聯而促進血管內皮細胞增殖、遷移[20]。優點:VEGF是刺激新生血管形成的直接因素,可以避免炎癥刺激等其他因素的影響。

2.2 bFGF緩釋藥丸誘導法造模方法[21]:首先制備bFGF緩釋藥丸:顯微鏡下將醫用明膠海綿片剪成1mm× 1mm×0.5mm的小片,浸入4℃PBS緩沖液過夜后,用無菌濾紙將水份吸干。于明膠海綿小片上滴加1μL(500ng/μL PBS)bFGF,完全吸收后將小片置于超凈臺內干燥48 h。取出將此小丸浸入20g/L瓊脂糖溶液包裹后置于超凈臺內干燥48h。無菌條件下將bFGF藥丸植入角膜層間。效果:手術后1～4d,可見局部角膜輕度水腫,毛細血管芽自角膜緣長出,血管成束向植入物方向延伸,血管生長范圍較小且管徑較細。此后,角膜新生血管逐漸融合,管徑變粗,向角膜中心延伸并逐漸包裹藥丸。7～10d血管生長達到高峰,角膜基質明顯充血,血管密集,管徑粗大,完全包裹植入物。14d以后新生血開始消退[21]。原理:bFGF可以促進內皮細胞的增殖、分化和遷移,通過刺激內皮細胞的有絲分裂而刺激血管形成。此外bFGF通過對有絲分裂的影響和與一種有絲分裂無關的類激素活動的影響增加毛細血管生成,引起角膜新生血管[22]。bFGF誘發內皮細胞產生大量的尿激酶型纖溶酶激活物(urokinase type plasminogen activator,u-PA)在早期血管生成起作用,產生有活性的纖維蛋白溶酶,激活膠原酶溶解血管邊緣的膠原蛋白,促進內皮細胞增殖分化,遷移至三維的膠原基質,誘導血管形成[23-25]。此外,Yang等[26]發現bFGF對新血管形成的影響與積極的線性關系相關劑量。優點:bFGF是血管生成的直接促進因子,能夠刺激血管內皮細胞分裂,可排除炎癥等間接的新生血管刺激因素,有利于新生血管抑制劑的療效評價。缺點:該模型制作操作復雜,影響因素多。

2.3 內毒素緩釋聚合物誘導法這種方法是通過在角膜層間植入內毒素緩釋聚合物誘導新生血管形成。內毒素是革蘭陰性細菌的細胞壁的組成部分,其化學本質為脂多糖。這是研究血管生成抑制劑的可靠模型。造模方法[27-28]:制備內毒素藥丸:制備分別含緩釋聚合內毒素15%、30%、40%的藥丸,乙烯醋酸乙烯酯共聚物珠用高純度乙醇沖洗達到分光光度純度,室溫條件下,將內毒素藥丸溶解于二氯甲烷中至濃度10%。將模具放在干冰上預冷卻,在工作表面一面覆蓋玻璃板,放止內毒素在模具中濃縮,用無菌玻璃管取內毒素-Elvax聚合。固體放置于-20℃條件下24h完成聚合,自然揮發48h蒸發殘余溶劑。聚合物顆粒切成種1mg藥丸,植入之前用紫外線照射消毒。無菌條件下將內毒素藥丸角膜層間。效果[29]:結果顯示,植入含15%內毒素的角膜產生輕微的角膜水腫,術后只持續3～4d。更高水平的內毒素(30%和40%)誘導良好的新生血管反應并在24h內伴隨嚴重的角膜水腫。組織學檢查角膜,植入含15%內毒素藥丸的一組顯示,植入后16d新生血管從角膜邊緣長入角膜囊袋。內毒素誘生CNV對局部內毒素有依賴性,對內毒素濃度的嚴格控制可以誘導不同程度的模型適應研究需求。內毒素濃度過高會導致基質混濁,血管生長過密且容易相互吻合,影響血管的定量測定。但是如果內毒素濃度過低,新生血管數量過少,難以達到模型要求[28]。優點:內毒素誘導的CNV動物模型的優點為誘導的新生血管范圍僅占角膜整個圓周的10%～20%,便于進行動態定量測定,并且術者可以通過控制植入緩釋內毒素聚合物的濃度誘導出重度、中度、輕度CNV模型,適應不同研究需要[29]。缺點:操作復雜,影響因素多,手術創傷本身即可引起CNV形成,影響實驗結果的判定。

3 免疫原性CNV模型

免疫原性家兔CNV模型的制作包括異種或同種異體角膜移植、角膜基質內注射牛蛋白(BA)等方法。同種異體角膜移植誘導免疫原性CNV模型。造模方法[30]:在實驗動物家兔中隨機抽取一部分作為供體,另一部分作為受體。取下供體眼球,剪下角膜用環鉆切割后制成植片。麻醉受體兔,用7.25mm環鉆切割受體角膜制作受體植床。對稱地縫合植片與植床,共計12～16針。術后為預防感染,眼表滴抗生素眼液。效果[30]:術后可觀察到毛細血管芽自角膜緣向透明角膜長入,向植片中央生長并逐漸包繞植片,植片發生水腫,最后植片植床產生排斥反應,植片的平均存活時間為11.0±1.5d。原理:當同種異體角膜進入機體時,會被受體免疫系統識別而成為抗原刺激產生機體液免疫反應,形成免疫復合物并沉積于毛細血管基底膜和角膜組織中,由此激活補體,趨化單核巨噬細胞系統浸潤,誘導血管生成[31]。優點:該模型CNV發生機制與人角膜移植術后排斥反應而誘發CNV的機制一致,與人類疾病病程非常相近,是研究人角膜移植術后排斥反應機制、發病原因、及治療的理想模型。缺點:操作復雜,手術技術要求較高,干擾因素較多,供體受體發生免疫排斥的程度差異較大。應用現狀:此方法多應用于疫排斥反應的調控機制及治療方法的研究中[32-33]。

4 其他家兔CNV模型

能夠誘導CNV增生的原因多種多樣,目前也已經培育出多種動物模型用于研究引起某疾病的原因。除以上CNV模型的獲得方式以外,還有一些不常用的造模方式,如對家兔角膜上皮機械刮除、角膜基質中腫瘤組織植入術、機械造瓣等方法用于制作動物CNV模型[34]。與上述模型相比較來看,這些模型基本上均有更加明顯的缺點,如造模后反應一致性較差,基線難于控制在同一水平線,定量分析比較困難等[35-36]。

以上幾種CNV造模方法各有利弊,其中角膜縫線法和堿燒傷法成本較低、操作簡單,是目前實驗研究中最為廣泛應用的兩種;角膜層間植入誘導劑模型主要應用于血管形成過程中對特定刺激因子的研究;免疫原性CNV模型主要用于角膜移植后發生免疫排斥的研究。CNV動物模型的研究是人類新生血管性眼病疾病研究的基礎,目前來看現有的實驗模型已能夠大致復制出各種引起CNV的主要因素,滿足研究需要,模擬出臨床上人類CNV的疾病表現。

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Progress on the establishment of corneal neovascularization animal model

Shu-Rong Wang1,Shu-Ci Tian2,Xin Liu1,Yu-Xi He1,Ying Li1,Guan-Fang Su1,Yan Zhang1

1Department of Ophthalmology,the Second Hospital of Jilin University,Changchun 130041,China;2Norman Bethune Health Science Center of Jilin University,Changchun 130021,China

Foundation item:International Cooperation Project of Science and Technology Office of Jilin(No.20130413025GH)

Yan Zhang.Department of Ophthalmology,the Second Hospital of Jilin University,Changchun 130041,China. zhangy66@jlu.edu.cn

·Corneal neovascularization(CNV)is the extensive growth of blood vessels from conjunctiva into cornea. Abnormal angiogenesis plays an importantrole in the process of CNV,which may result from corneal wound and self-healing.The pathologic growth of blood vessels blocks light,promotes scar formation and causes inflammation,which impairs visual acuity.It is a sight threatening condition that can decreases eyesight and even leads to blindness.Neovascular eye disease is one of the most common eye diseases in clinical admissions. So,further mechanistic studies are the key to the prevention and treatment of CNV.Determination on the CNV animal models is essential in eye diseases researches.Several main methods of CNV mode ls establishment are summarized in this review.

cornea;vascularization;model;establishment

吉林省科技廳國際合作項目(No.20130413025GH)

作者單位:1(130041)中國吉林省長春市,吉林大學第二醫院眼科醫院;2(130021)中國吉林省長春市,吉林大學諾爾曼白求恩健康研究中心

王淑榮,博士,副主任醫師,研究方向:眼表疾病。

張妍,博士,主治醫師,研究方向:眼表疾病.zhangy66 @jlu.edu.cn

2015-06-03

2015-10-22

:Wang SR,Tian SR,Liu X,et al.Progress on the establishment of corneal neovascularization animal model.Guoji Yanke Zazhi(Int Eye Sci)2015;15(11):1892-1895

10.3980/j.issn.1672-5123.2015.11.14

Received:2015-06-03 Accepted:2015-10-22