不同品種蘑菇的培養基質中胞外酶活性研究

關麗杰， 田 璐

(沈陽化工大學 制藥與生物工程學院， 遼寧 沈陽 110142)

不同品種蘑菇的培養基質中胞外酶活性研究

關麗杰， 田 璐

(沈陽化工大學 制藥與生物工程學院， 遼寧 沈陽 110142)

該研究分別從9種不同品種的蘑菇培養基質中提取幾丁質酶和殼聚糖酶2種胞外酶并測定其酶活力.結果表明：平菇的培養基質中幾丁質酶的活性最高，達33 U/g培養基質；金針菇的培養基質中殼聚糖酶的活性最高，達21.062 U/g培養基質.根據酶活測定的結果選取其中3種酶活較高的培養基質進行抑菌活性的研究.結果表明:3種培養基質的粗酶液對蠟樣芽孢桿菌、番茄細菌性潰瘍病菌和巨大芽孢桿菌3種病原菌均有抑制活性，且對巨大芽孢桿菌的抑菌活性最強.

蘑菇培養基質； 幾丁質酶； 殼聚糖酶； 酶活力測定； 抑菌活性

幾丁質(chitin)及殼聚糖(chitosan)是自然界中比較豐富的多聚糖，通過幾丁質酶(chitinase)和殼聚糖酶(chitosanase)的作用,幾丁質和殼聚糖將分別被降解為乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖.在某些植物病原菌的細胞壁中含有殼聚糖，在降解殼聚糖的方面，幾丁質酶和殼聚糖酶之間沒有明顯的區別,二者均能降解不同乙?；降臍ぞ厶荹1]，達到抑制病原菌的目的.在植物中殼聚糖酶可以抵抗植物病原菌的感染，可作為植物功能調節劑，增強植物對病蟲害的防御能力.因此，可以以此開發生產生物農藥.而且殼聚糖酶是一種RP蛋白，可以提高植物的抗病能力[2].其降解產物幾丁寡糖和殼寡糖具有許多生物活性，比如抗真菌、抗細菌、抗癌、抗感染、提高機體免疫力、降低膽固醇和促進鈣的吸收等，且易溶于水，有吸濕性和保濕性，在食品、醫藥、農業和化妝品等領域有廣泛的應用[3-11].

幾丁質酶在一定的環境下能夠水解幾丁質,幾丁質在害蟲和植物病原真菌中廣泛存在[12]，所以,幾丁質酶在植物病蟲害防治中具有重要作用.另外，通過生化方法制備高純度的幾丁質酶還可以作為外用藥物,用于治療人類由真菌引起的疾病.在國外,幾丁質酶還用來處理幾丁質廢物,由于蝦、蟹殼是細菌生長繁殖的有利場所,不有效處理廢殼,極易對環境造成污染,采用幾丁質酶進行水解處理,不僅徹底有效而且對環境沒有影響[13-16].

本研究選取9種不同品種蘑菇的培養基質，旨在從中提取出幾丁質酶及殼聚糖酶，并對其酶活性及其抑菌活性進行研究，為兩種酶的進一步分離純化做一些基礎工作.

1 材料與方法

平菇(Pleurotusostreatus)、猴頭菇(Hericiumerinacium)、真姬菇(Hypsizygusmarmoreus)、黃傘菌菇(Pholiotaadipose)、毛木耳(Auriculariapolytricha)、滑子蘑(Pholiotanameko)、大白樁菇(Leucopaxillusgiganteus)、金針菇(Flammulinavelutipes)、金頂側耳(Pleurotuscornucopiaevar.citrinopileatus)9種蘑菇的培養基質.

病原菌包括大腸桿菌(Escherichiacoli)、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、番茄細菌性潰瘍病菌(Clavibactermichiganensissubsp.michiganensis)和巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)4種.

1.2 試 劑

乙二醇幾丁質(EGC)購自日本WAKO公司；脫乙酰幾丁質酶檢測底物(AZCL-chitosan)購自愛爾蘭Megazyme公司；N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)、營養肉湯等試劑均為日本生產.

1.3 各種溶液的配制

(1) 硼酸鈉溶液

（四）創新階段：打造共建共治共享的社會治理格局。2012年，黨的十八大提出“要圍繞構建中國特色社會主義社會管理體系，加快形成黨委領導、政府負責、社會協同、公眾參與、法治保障的社會管理體制”。首先，首次提出了要構建中國特色社會主義社會管理體系，并系統地闡述了社會管理需要“法治保障”，這一新內容表明社會管理要與法治相結合。其次，提出要把社會管理和社會建設統一起來，以“創新社會管理”來促進社會建設。最后，指出要加強創新社會管理體制，提高社會管理的科學化水平，積極鼓勵社會主體參與到社會管理中來。

稱取4.95 g H3BO3溶于50 mL蒸餾水中，用1 mol/L NaOH調至pH 9.1.

(2) DMAB(4-二甲氨基苯甲醛)溶液

稱取10 g DMAB溶于100 mL的HCl與冰醋酸混合溶液中，其混合比例為：V(10 mol/L HCl)/V(冰醋酸)=12.5 %.此溶液可在2 ℃保存2個月，使用時需用冰醋酸稀釋10倍.

(3) 0.2 mol/L pH 5.0 醋酸-醋酸鈉緩沖液

取0.2 mol/L 醋酸溶液30 mL和0.2 mol/L醋酸鈉溶液70 mL，混勻.

1.4 幾丁質酶及殼聚糖酶的提取方法

將10 mL 0.15 mol/L的NaCl溶液加入到1 g 培養基質中，于4 ℃冰浴研磨,研磨成勻漿后用無菌濾紙過濾，濾液置于無菌離心管中，10 000 r/min冷凍離心10 min，取上清液,用0.22 μm的細菌過濾器過濾，即制成幾丁質酶及殼聚糖酶的粗酶液.

1.5 幾丁質酶的酶活力測定

根據Reissig[17]的方法，反應體系的總體積為500 μL，包含125 μL 質量分數為0.2 %的乙二醇幾丁質(EGC)溶液，125 μL 0.2 mol/L pH 5.0 的醋酸-醋酸鈉緩沖液，100 μL H2O和150 μL酶液.30 ℃下水浴1 h,加入0.1 mL硼酸鈉溶液，沸水浴3 min，終止反應移入冷水中，再加入3 mL DMAB溶液，混勻后37 ℃水浴20 min，移入冷水中后以蒸餾水為對照在544 nm處測吸光度值，根據N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)標準曲線計算其酶活力.

一個酶活力單位(U)定義為：每克培養基質1 min內催化分解產生1 nmol GlcNAc的還原糖所需的酶量(nmol GlcNAc·min-1·g-1w).

1.6 殼聚糖酶的酶活力測定

在微量離心管中加入250 μL 0.2 mol/L pH 5.0 的醋酸-醋酸鈉緩沖液，650 μL H2O，100 μL酶液和2 mg 脫乙酰幾丁質酶檢測底物(AZCL-chitosan)，在直立式旋轉攪拌器上30 ℃反應5 h，然后將混合物在10 000 r/min下冷凍離心5 min，取上清液,以蒸餾水為對照在660 nm處測吸光度值，根據N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAc)標準曲線計算其酶活力.

一個酶活力單位(U)定義為：每克培養基質1 min內催化分解1 μg AZCL-chitosan所需的酶量(μg Azcl-chitosan·min-1·g-1w).

1.7 粗酶液抑菌活性檢測

在10 mL的營養肉湯培養基中分別接種大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、馬鈴薯環腐病菌和巨大芽孢桿菌，37 ℃、150 r/min搖床過夜培養.然后取150 μL的過夜細菌培養液加入到20 mL 44 ℃ 質量分數為1.5 %的瓊脂培養基中，輕輕混勻后即制成混菌平板.用孔徑為0.8 cm的無菌打孔器在凝固后的混菌平板上打孔，每個孔中注入150 μL的粗酶液，以同樣的混菌平板每個孔中注入150 μL蒸餾水為空白對照，30 ℃培養72 h后記錄抑菌情況.通過測量抑菌圈直徑的大小，檢測粗酶液抑菌活性.

2 結果與分析

2.1 9種不同品種蘑菇的培養基質中幾丁質酶的酶活力

提取9種不同品種蘑菇培養基質的粗酶液，測定其幾丁質酶的酶活力.研究發現：不同品種蘑菇的培養基質中所含的幾丁質酶酶活力差異很大.由圖1可看出：在從9種蘑菇的培養基質中所提取出來的粗酶液中，幾丁質酶酶活力由高到低分別為平菇33 U/g培養基質，金針菇25.868 U/g培養基質，猴頭菇21.131 U/g培養基質，滑子蘑9.695 U/g培養基質，真姬菇7.164 U/g培養基質，黃傘菌菇5.881 U/g培養基質，毛木耳4.086 U/g培養基質，金頂側耳3.828 U/g培養基質，大白樁菇1.392 U/g培養基質.可見，平菇、金針菇和猴頭菇的培養基質中幾丁質酶的酶活均較高，由此推斷在這3種蘑菇的培養基質中幾丁質酶的含量較高.

1 平菇 2 猴頭菇 3 真姬菇 4 黃傘菌菇 5 毛木耳 6 滑子蘑 7 大白樁菇 8 金針菇 9 金頂側耳

圖1 9種不同品種蘑菇的培養基質中幾丁質酶的酶活力

Fig.1 The activity of chitinase from 9 species of mushroom waste medium

2.2 9種不同品種蘑菇的培養基質中殼聚糖酶的酶活力

用同樣的方法提取9種不同品種蘑菇的培養基質的粗酶液，測定其殼聚糖酶的酶活力.研究發現：不同品種蘑菇的培養基質中所含的殼聚糖酶酶活力的差異也很大.由圖2可看出：在從9種蘑菇的培養基質中所提取出來的粗酶液中，殼聚糖酶酶活力由高到低分別為金針菇21.062 U/g培養基質，猴頭菇19.48 U/g培養基質，平菇8.095 U/g培養基質，毛木耳3.416 U/g培養基質，滑子蘑2.761 U/g培養基質，黃傘菌菇1.942 U/g培養基質，大白樁菇1.404 U/g培養基質，真姬菇0.975 U/g培養基質，而測得金頂側耳的培養基質中殼聚糖酶的酶活為0，說明其培養基質中不含有殼聚糖酶.可見，除金針菇、猴頭菇和平菇的培養基質中殼聚糖酶的酶活較高外，其余種類蘑菇的培養基質中殼聚糖酶的酶活均比較低,由此可以推斷金針菇、猴頭菇和平菇這3種蘑菇的培養基質中殼聚糖酶的含量較高，與幾丁質酶的含量相吻合，故推斷這兩種酶在此3種蘑菇的培養基質中是同時存在的.

1 平菇 2 猴頭菇 3 真姬菇 4 黃傘菌菇 5 毛木耳 6 滑子蘑 7 大白樁菇 8 金針菇 9 金頂側耳

2.3 粗酶液抑菌作用

以大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、番茄細菌性潰瘍病菌和巨大芽孢桿菌為病原菌，結合幾丁質酶和殼聚糖酶活力的測定結果，選取幾丁質酶及殼聚糖酶酶活均較高的培養基質，即平菇、猴頭菇及金針菇的培養基質的粗酶液進行抑菌活性研究.

測量抑菌圈直徑見表1.可見，3種蘑菇培養基質的粗酶液中平菇培養基質的粗酶液對大腸桿菌沒有抑菌活性，但對其他3種病原菌均有抑菌活性，且對番茄細菌性潰瘍病菌和巨大芽孢桿菌的抑菌活性差異不大，其中對番茄細菌性潰瘍病菌的抑菌活性最高，抑菌圈直徑達2.02 cm；其次是巨大芽孢桿菌，抑菌圈直徑為1.92 cm；最后為蠟樣芽孢桿菌，抑菌圈直徑為1.15 cm.猴頭菇培養基質的粗酶液對大腸桿菌也沒有抑菌活性，但對其他3種病原菌均有抑菌活性，且差異不大，其中對巨大芽孢桿菌的抑菌活性最高，抑菌圈直徑達2.20 cm；其次是番茄細菌性潰瘍病菌，抑菌圈直徑為2.03 cm；最后為蠟樣芽孢桿菌，抑菌圈直徑為1.85 cm.金針菇培養基質的粗酶液對4種病原菌均有抑菌活性，除對大腸桿菌抑制活性較小外，對其余3種病原菌的抑菌活性差異不大，其中對巨大芽孢桿菌的抑菌活性最高，抑菌圈直徑達2.18 cm；其次是蠟樣芽孢桿菌，抑菌圈直徑為2.06 cm；再次是番茄細菌性潰瘍病菌，抑菌圈直徑為1.93 cm，最后是大腸桿菌，抑菌圈直徑為1.31 cm.

通過以上結果可以看出：對于大腸桿菌，只有金針菇培養基質的粗酶液對其有輕微的抑制活性，而平菇和猴頭菇的培養基質的粗酶液對其均沒有抑制活性；對于蠟樣芽孢桿菌，金針菇培養基質的粗酶液對其抑制活性最強，猴頭菇次之，平菇最弱；對于番茄細菌性潰瘍病菌，猴頭菇培養基質的粗酶液對其抑制活性最強，平菇次之，金針菇最弱；對于巨大芽孢桿菌，猴頭菇培養基質的粗酶液對其抑制活性最強，金針菇次之，平菇最弱.

表1 不同品種蘑菇培養基質粗酶液的抑菌活性

3 結 論

研究選取了9種不同品種蘑菇的培養基質，從中提取粗酶液后對其酶活進行檢測，結果表明：相同品種蘑菇的培養基質中幾丁質酶和殼聚糖酶的活性不同，其中幾丁質酶活性最高的是平菇的培養基質，酶活達33 U/g培養基質；殼聚糖酶活性最高的是金針菇的培養基質，酶活達21.062 U/g培養基質.

結合酶活檢測的結果，選取幾丁質酶和殼聚糖酶活性均較高的3種蘑菇的培養基質，分別為平菇、猴頭菇和金針菇的培養基質，提取粗酶液后進行抑菌活性研究.結果表明3種粗酶液對蠟樣芽孢桿菌、番茄細菌性潰瘍病菌和巨大芽孢桿菌均有抑制活性，除平菇培養基質的粗酶液對蠟樣芽孢桿菌的抑制活性較小外，其余的抑菌活性均差異不大，抑菌圈直徑均在2 cm左右；3種蘑菇的培養基質中，只有金針菇培養基質的粗酶液對大腸桿菌有抑制活性且較小外，其余2種均沒有，說明這3種蘑菇培養基質的粗酶液對大腸桿菌的抑制效果均不好，但對其他3種病原菌的抑制效果均很明顯.

在農業生產中，蘑菇的培養基質為廢棄物，人們只能用它燒火或直接丟棄，對環境造成了嚴重污染且產生了巨大浪費.本研究從這些廢棄物中提取出了應用廣泛的幾丁質酶及殼聚糖酶，起到廢物回收利用的作用，減輕了環境的污染，對酶的研究及環境保護具有重要意義.

幾丁質酶及殼聚糖酶不僅可以降解自然界中的幾丁質和殼聚糖，產生許多有用的產物,而且有些幾丁質酶和殼聚糖酶自身還兼具溶菌酶活性,可分解細菌細胞壁的肽聚糖,從而具有抗菌作用,對細菌、真菌、昆蟲、螨等表現出一定抗性[18-19].目前，雖然對幾丁質酶及殼聚糖酶的研究報道較多，但大多是從動植物及微生物中提取的，而本文是從蘑菇的廢棄培養基質中提取，具有一定的工業應用價值.但由于其多樣性、調控機理的復雜性，再加上從自然界中分離到的酶活性不是太高，因此，距離工業應用的要求還有一定距離.今后應進一步加強對幾丁質酶及殼聚糖酶的基礎理論研究，并利用現代生物學技術對現有的幾丁質酶及殼聚糖酶進行定向改造或篩選出新的活性更強的幾丁質酶，以適應工業化生產的需要.

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antimicrobial activity

Activity of Extracellular Enzyme from Different Species of Mushroom Waste Media

GUAN Li-jie， TIAN Lu

(Shenyang University of Chemical Technology, Shenyang 110142, China)

This experiment extracted chitinase and chitosanase from 9 species of mushroom waste media and then determined their enzyme activity.The research showed that the chitinase activity of waste medium of Pleurotus ostreatus could reach to 33 U/g waste medium,which was the best;the chitosanase activity of waste medium of Flammulina velutipes could reach to 21.062 U/g waste medium,which was the best.According to the result,3 species of mushroom waste media whose chitinase and chitosanase activity were higher were screened to assay their antimicrobial activity.The research showed that this 3 species of crude extract of chitinase and chitosanase from waste medium all had inhibitory activity against Bacillus cereus,Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis and Bacillus megaterium,which was the best.

mushroom waste medium； chitinase； chitosanase； determination of enzyme activity；

2013-11-06

關麗杰(1968-)，女(滿族)，遼寧沈陽人，副教授，博士，主要從事生物農藥及植物病理學的研究.

2095-2198(2015)02-0118-05

10.3969/j.issn.2095-2198.2015.02.005

Q556+.2

A