高效抑菌性能的聚乳酸/銀納米纖維的制備及生物特性

張 碩， 楊 鳳， 何曉峰， 張賀新， 張學(xué)全

(1.沈陽(yáng)化工大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院， 遼寧 沈陽(yáng) 110142；2.中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所， 吉林 長(zhǎng)春 130022)

高效抑菌性能的聚乳酸/銀納米纖維的制備及生物特性

張 碩1， 楊 鳳1， 何曉峰1， 張賀新2， 張學(xué)全2

(1.沈陽(yáng)化工大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院， 遼寧 沈陽(yáng) 110142；2.中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所， 吉林 長(zhǎng)春 130022)

通過(guò)對(duì)聚乳酸和銀納米粒子的1,1,1,3,3,3-六氟代-2-丙醇(HFIP)溶液進(jìn)行靜電紡絲，制備具有不同銀粒子濃度的聚乳酸/銀納米纖維材料，并對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞活性及抗菌性等方面的測(cè)定.研究發(fā)現(xiàn):制備的聚乳酸/銀納米纖維直徑分布在200～600 nm之間，銀納米粒子在纖維內(nèi)分散均勻，無(wú)團(tuán)聚發(fā)生，當(dāng)銀納米顆粒質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2 %時(shí)，即具備優(yōu)良的抗菌殺菌性能(殺菌性>99 %)，同時(shí)纖維材料保持了良好的細(xì)胞相容性.

聚乳酸； 銀納米顆粒； 納米纖維； 生物材料

眾所周知，銀粒子被廣泛應(yīng)用于抗菌和殺菌，具有高效、廣譜的抗微生物能力，可應(yīng)用于生物醫(yī)用材料[1-5].銀可以在細(xì)菌體外使兩種微生物DNA鏈接，預(yù)防細(xì)菌的復(fù)制，并且可與細(xì)菌新陳代謝酶中的巰基作用，使新陳代謝酶失活.在生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，銀可以通過(guò)溶膠-凝膠法、離子注入法、離子交換法、濺射等離子噴涂和靜電紡絲法等融入聚合物中[6-11],其中靜電紡絲法由于成本低廉、操作相對(duì)簡(jiǎn)便，因此，被認(rèn)為是一種有效制備納米復(fù)合纖維的技術(shù).

以往聚合物/銀粒子纖維的制備大致分為兩步：首先把聚合物和硝酸銀混合溶液進(jìn)行靜電紡絲，然后利用還原試劑把纖維中的銀離子還原成單質(zhì)銀.徐效義[11]等通過(guò)對(duì)聚乳酸/硝酸銀溶液進(jìn)行靜電紡絲，并利用高壓氫氣對(duì)硝酸銀進(jìn)行還原處理，制備出直徑在0.27～3.41 μm之間的聚乳酸/銀納米纖維，發(fā)現(xiàn)其對(duì)金黃色葡萄球菌(S.aureus)和大腸埃希菌(E.coli)有抑制作用.這種制備方法可以有效避免銀粒子在纖維內(nèi)的團(tuán)聚，但缺點(diǎn)是制備過(guò)程中要使用大量的硝酸銀，這樣勢(shì)必產(chǎn)生細(xì)胞毒性，細(xì)胞相容性很差，制備過(guò)程由于使用氫氣,存在安全隱患.

本文以獲得更高效抑菌性能的納米材料為目的,通過(guò)靜電紡絲法，選擇合適尺寸的銀納米粒子，結(jié)合超聲技術(shù)，制備出聚乳酸/銀納米顆粒纖維，并對(duì)其進(jìn)行纖維結(jié)構(gòu)、細(xì)胞相容性及其在金黃色葡萄球菌和肺炎克氏桿菌中的抗菌殺菌性能測(cè)試.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

聚乳酸，特性黏度：2.0 dL/g,購(gòu)于Sigma-Aldrich.1,1,1,3,3,3-六氟代-2-丙醇(HFIP)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99 %，購(gòu)于百靈威.銀納米粒子，直徑<10 nm，韓國(guó)Hunion公司.

1.2 聚合物溶液的制備

將聚乳酸加入到HFIP溶劑中，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15 %，在室溫下攪拌12 h直到聚乳酸全部溶解.然后將定量的銀納米顆粒加入到上述溶液中，攪拌24 h，使其混合均勻，紡絲前在超聲水浴中超聲20 min，使銀納米粒子均勻分散.

1.3 聚乳酸/銀納米顆粒纖維的制備

在15 kV的電壓下將適量的上述聚乳酸/銀納米顆粒的溶液加入到10 mL的注射器中，注射器前端連有20 G的針頭,針頭與電源正極相連，注射器末端連有注射泵，在針頭正前方放置有與電源負(fù)極相連并作為接收屏的鋁箔，針頭距接收屏15 cm，溶液推進(jìn)速度為1.0 mL/h，電紡操作于室溫下進(jìn)行.獲得的納米纖維形貌用掃描電子顯微鏡(Field Emission Scanning Electron Microscope，F(xiàn)E-SEM,Hitachi,Japan)及透射電子顯微鏡(Transmission Electron Microscope,TEM,Hitachi,Japan)進(jìn)行觀(guān)察.纖維表面透射電鏡樣品通過(guò)銅網(wǎng)直接收集后進(jìn)行測(cè)試，纖維內(nèi)部(斷面)透射電鏡樣品通過(guò)將纖維包埋于環(huán)氧樹(shù)脂中，然后通過(guò)切片機(jī)(Microtome)液氮冷凍進(jìn)行切片.

1.4 細(xì)胞的培養(yǎng)

先將纖維細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，再將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90 %的DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium,低糖，1 000 mg/L葡萄糖，L-谷氨酰胺，110 mg/L丙酮酸鈉)和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 %的優(yōu)級(jí)胎牛血清(Fetal Bovine Serum)、100 U/mL盤(pán)尼西林和100 g/L 鏈霉素分別加入培養(yǎng)皿中.在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5 %的CO2及飽和濕度的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng).細(xì)胞呈單層貼壁生長(zhǎng)，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)覆蓋面積達(dá)80 %或融合成片時(shí)即可開(kāi)始實(shí)驗(yàn).首先收集細(xì)胞懸液，離心，臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)計(jì)數(shù)，將1 mL細(xì)胞溶液(3×104cells/mL)加入到納米纖維的表面并進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)4 h和72 h后進(jìn)行固定化、干燥,用掃描電鏡對(duì)細(xì)胞黏著進(jìn)行觀(guān)察.

1.5 細(xì)胞活性測(cè)定

將1 mL細(xì)胞溶液(3×104cells/mL)在納米纖維的表面培養(yǎng)3 d后，每孔加入100 μL MTT 溶液(1 g/L) 繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清,加入100 μL二甲基亞砜(DMSO)，待細(xì)胞裂解和藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)完全溶解后，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(ELISA)在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，根據(jù)吸光度值大小計(jì)算反應(yīng)活細(xì)胞數(shù)量.

1.6 殺菌率的測(cè)定

將準(zhǔn)備好的菌液分別移取1 mL加在已經(jīng)準(zhǔn)備好的盛有材料試樣(0.2 g)的試管中,在37 ℃ 恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后,將對(duì)照菌液和與樣品接觸過(guò)的菌液各100 μL滴入到瓊脂培養(yǎng)基上，確保菌液均勻分布后在37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，相機(jī)拍照，通過(guò)觀(guān)察培養(yǎng)皿內(nèi)菌株數(shù)目變化確定殺菌率.

2 結(jié)果與討論

2.1 聚乳酸/銀納米顆粒纖維表面形態(tài)

圖1為含有不同銀納米顆粒濃度的聚乳酸/銀納米顆粒纖維的場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡圖片.

圖1 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的銀納米顆粒的聚乳酸/銀納米顆粒纖維的場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡圖片

由于銀納米顆粒具有良好的導(dǎo)電性，因此，制備的聚乳酸/銀納米顆粒纖維的直徑隨銀納米顆粒濃度的增加而變細(xì)[12-13].聚乳酸納米纖維直徑為(500±46)nm(圖1(a))，當(dāng)加入0.2 %(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，以下同)銀納米顆粒時(shí)，纖維的直徑減小到(420±37)nm(圖1(c)).圖2為聚乳酸/銀納米顆粒纖維(PLA/0.2 %Ag)的透射電子顯微鏡圖片.由圖2可以明顯觀(guān)察到銀納米顆粒均勻分布在聚乳酸纖維表面(圖2(a))及內(nèi)部(圖 2(b)).無(wú)團(tuán)聚現(xiàn)象的原因在于：實(shí)驗(yàn)中選擇的銀納米顆粒尺寸較小(<10 nm)，因此，受重力影響小，在超聲作用下，能夠在黏度較大的紡絲溶液中較長(zhǎng)時(shí)間均勻分布；在電場(chǎng)中銀納米顆粒帶有相同的電荷，在排斥力的作用下，銀納米顆粒避免了在紡絲溶液中團(tuán)聚，進(jìn)而在紡絲后形成的纖維中得以均勻分布.

圖2 銀納米顆粒(PLA/0.2 %Ag)分布在聚乳酸纖維表面及內(nèi)部的透射電子顯微鏡圖片

2.2 聚乳酸/銀納米顆粒纖維的生物相容性

理想的組織工程支架材料必須能夠提供細(xì)胞的附著和生長(zhǎng),并且，可以抑制和殺死細(xì)菌.為了評(píng)估所制備的聚乳酸/銀納米顆粒纖維的生物相容性，將纖維細(xì)胞接種在聚乳酸/銀納米顆粒纖維上，并通過(guò)FE-SEM考察細(xì)胞在聚乳酸/銀納米顆粒纖維上的生長(zhǎng)行為.

胚胎成纖維細(xì)胞系附著在聚乳酸、聚乳酸/0.1 %銀納米顆粒、聚乳酸/0.2 %銀納米顆粒纖維上，培養(yǎng)4 h，其掃描電子顯微鏡圖片如圖3所示，纖維細(xì)胞均勻地黏著在聚乳酸/銀納米顆粒纖維(圖3(b)、(c))表面并開(kāi)始延伸生長(zhǎng)，與在純PLA聚乳酸納米纖維骨架上的細(xì)胞(圖3(a))形貌幾乎相同.

圖3 胚胎成纖維細(xì)胞系附著在不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的銀納米顆粒的聚乳酸/銀納米顆粒纖維上的掃描電子顯微鏡圖片(培養(yǎng)4 h)

從圖4中可以看出：當(dāng)纖維細(xì)胞在聚乳酸和聚乳酸/銀納米顆粒纖維上經(jīng)過(guò)72 h的培養(yǎng)后，細(xì)胞會(huì)以單層形式分布在聚乳酸和聚乳酸/銀納米顆粒纖維表面.通過(guò)該結(jié)果可以得出富含銀納米顆粒的聚乳酸納米纖維對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性.

圖4 胚胎成纖維細(xì)胞系附著在不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的銀納米顆粒的聚乳酸/銀納米顆粒纖維上的掃描電子顯微鏡圖片(培養(yǎng)72 h)

圖5為聚乳酸及聚乳酸/銀納米顆粒纖維的細(xì)胞增殖72 h數(shù)據(jù)(其中450 nm為測(cè)試波長(zhǎng)，690 nm為參比波長(zhǎng)).

圖5 聚乳酸及聚乳酸/銀納米顆粒纖維的細(xì)胞增殖72 h數(shù)據(jù)

從圖5中可以看出：聚乳酸和聚乳酸/銀納米顆粒纖維的細(xì)胞活性差別較小，也表明富含銀納米顆粒的聚乳酸納米纖維對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性.

2.3 聚乳酸/銀納米顆粒纖維的抗菌殺菌性

為了進(jìn)一步研究聚乳酸/銀納米顆粒纖維在抗菌殺菌方面的性能，將聚乳酸及聚乳酸/銀納米顆粒纖維置于兩種不同的細(xì)菌中進(jìn)行測(cè)試.如圖 6所示，在僅有聚乳酸存在的體系下，金黃色葡萄球菌和肺炎克氏桿菌均布滿(mǎn)表面皿，而當(dāng)含有0.1 %銀納米顆粒的聚乳酸纖維溶液所在的表面皿中僅有少量的金黃色葡萄球菌和肺炎克氏桿菌生存(殺菌率>90 %)，大多數(shù)金黃色葡萄球菌或肺炎克氏桿菌均被銀納米顆粒殺死.當(dāng)銀納米顆粒質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2 %時(shí)，表面皿中的細(xì)菌幾乎全部被殺死(殺菌率>99 %)，具有高效的抗菌殺菌作用.同時(shí)，由于聚乳酸/銀納米纖維所加入的銀含量較低，可有效降低制備成本.因此，聚乳酸/銀納米纖維有望成為一類(lèi)優(yōu)秀的生物醫(yī)用材料(如傷口敷料等).

(a)、(b)、(c) 葡萄球菌 (d)、(e)、(f) 肺炎克氏桿菌

3 結(jié) 論

通過(guò)靜電紡絲法制備了直徑為200～600 nm的聚乳酸/銀納米顆粒纖維絲，通過(guò)測(cè)試發(fā)現(xiàn)銀納米粒子均勻分布在纖維表面和內(nèi)部.銀納米粒子的引入，不僅保持了聚乳酸良好的細(xì)胞相容性，同時(shí)賦予了聚乳酸纖維優(yōu)良的抗菌和殺菌性能，使其有望成為一類(lèi)優(yōu)秀的、具有工業(yè)化前景的生物醫(yī)用材料.

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Preparation of Highly Efficient Antibacterial Poly(lactic acid)/Ag Nanofibers and Its Biological Properties

ZHANG Shuo1, YANG Feng1, HE Xiao-feng1, ZHANG He-xin2, ZHANG Xue-quan2

(1.Shenyang University of Chemical Technology, Shenyang 110142, China;2.Changchun Institute of Applied Chemistry Chinese Academy of Science, Changchun 130022， China)

In this research,poly(L-lactide)/Ag nanofibers containing different concentrations of Ag nanoparticles were prepared by electrospining a blend solution of poly(L-lactide) and silver nanoparticles in 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol(HFIP).The cell viability and antibacterial activity of the resultant nanofibers were investigated.According to the results,the diameter of the resulting nanofibers was in the range from 200 to 600 nm and the Ag nanoparticles were well dispersed(without aggregate).In addition,the poly(L-lactide)/Ag nanofibers exhibited excellent cell compatibility and significant antibacterial ability only containing small amount(0.2 %) of Ag nanoparticles.

poly(L-lactide); Ag nanoparticles; nanofiber; biomaterial

2013-11-06

張碩(1984-)，男，遼寧沈陽(yáng)人，碩士研究生在讀，主要從事高分子化學(xué)與物理方面的研究.

張賀新(1978-)，男，吉林長(zhǎng)春人，副研究員，博士，主要從事聚烯烴、合成橡膠及靜電紡絲方面的研究.

2095-2198(2015)02-0149-05

10.3969/j.issn.2095-2198.2015.02.012

O631

A