芝麻莖點枯病菌兩種細胞壁降解酶活性分析

高樹廣，趙 輝，李偉峰，王瑞霞，倪云霞，楊修身，劉紅彥＊，楊光宇

（1.河南省農業科學院植物保護研究所，鄭州 450002；2.河南省周口市農業科學院，周口 466001）

芝麻莖點枯病是危害芝麻最嚴重的真菌病害之一，該病害破壞性強，每年造成的損失高達30%以上。引起芝麻莖點枯病的病原菌菜豆殼球孢［Macrophominaphaseolina（Tassi）Goid］［1］，在世界范圍內能侵染500多種植物，具有土傳和種傳的特性，其菌核能在土壤或病殘體上存活4年以上［2］。

植物細胞壁是防止病原真菌侵入的屏障，也是寄主與病菌互作的重要場所［3］，植物細胞壁主要由多糖（如纖維素、半纖維素和果膠）、蛋白質和木質素等構成［4］。在長期的進化過程中，植物病原真菌能產生可降解植物細胞壁成分的胞外酶，這些酶通過消化植物細胞壁聚合物為病菌生長提供營養物質，輔助其在寄主組織中定殖和擴散［5］。漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，不但可降解木質素［6］，而且可促進纖維素和果膠等細胞壁成分的降解。研究表明，漆酶是許多病原真菌致病的毒力因子，例如，漆酶與板栗疫病菌的致病力［7］、根瘤菌的抗逆性和致病性密切相關［8］，在新生隱球菌的致病過程中起重要作用［9］。Islam 等對M.phaseolina基因組測序分析表明，其木質素降解酶系統包括漆酶、木質素過氧化物酶、半乳糖氧化酶、氯過氧化物酶、鹵過氧化物酶、血紅素過氧化物酶［10］。另一種細胞壁降解酶，聚甲基半乳糖醛酸酶（PMG）能作用于α-1，4鍵，使果膠中的聚半乳糖醛酸水解，釋放出單體的半乳糖醛酸，進而促使細胞的裂解。馮晶等［11］的研究結果表明，玉米彎孢霉葉斑病菌能按照一定的順序產生一系列細胞壁降解酶。陳夕軍等［12］認為水稻紋枯病菌（Rhizoctoniaso-laniKühn）的細胞壁降解酶在水稻紋枯病的暴發過程中起著重要作用，陳兵等［13］認為果膠酶與水稻紋枯病菌的致病性關系密切。目前，關于芝麻莖點枯病菌產生的細胞壁降解酶種類及活性分析鮮有報道［14-18］。本研究測定了芝麻莖點枯病菌漆酶（Lac）和聚甲基半乳糖醛酸酶（PMG）活性，分析比較了其變化規律，旨在為芝麻莖點枯病菌致病機理研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

芝麻莖點枯病菌共9株，分別于2009-2010年采集于河南、江西和安徽省，由河南省農業科學院植物保護研究所生防室分離保存（表1）。

表1 供試菌株Table 1 The tested strains

1.2 方法

1.2.1 菌株培養

將-20 ℃保存的9 株芝麻莖點枯病菌接種在PDA 培養基上，30 ℃黑暗培養2d，再轉接至新鮮PDA 培養基上30 ℃黑暗培養4d，備用。

1.2.2 芝麻莖點枯病菌漆酶活性

1.2.2.1 漆酶活性檢測

在培養4d的菌落平板上打取菌餅（d＝6mm），將菌餅分別接種到含0.03% ABTS［2，2-聯氮-雙（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽］和3g／L KNO3的PDA培養基平板中間、含0.01% 苯胺藍（azure-B）的BM 培養基（酵母膏10g，葡萄糖20g，瓊脂粉18g，水1 000mL）平板中間［19］，以菌餅接種在PDA培養基平板中間為空白對照，30℃黑暗培養3d。每天觀察培養基顏色變化情況，每個處理3次重復。

1.2.2.2 芝麻莖點枯病菌漆酶活性測定

將培養4d的產漆酶菌株菌餅接種到含有20mL Fries培養基（蔗糖30g，酒石酸鉀鈉7.7g，酵母提取物0.5g，NH4NO31g，KH2PO41g，MgSO40.5g，NH4Cl 2.9g，CaCl20.1g，CuSO4·5H2O 0.625g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH 4.0）的50 mL 三角瓶中，30 ℃黑暗靜置培養10d。培養物10 000r／min離心10 min，上清液用于胞外酶活力測定。菌絲用0.1mol／L Tris-HCl（pH 4.0）緩沖液沖洗2次后，加1mLTris-HCl重懸菌絲，-20 ℃冰凍過夜。在冰上迅速將冰凍的菌絲研磨成勻漿后轉移至10mL離心管中，再用1mL Tris-HCl緩沖液沖洗研缽，洗液轉入同一離心管，4℃10 000r／min離心10min，吸出上清液，即為粗酶液，用于胞內酶活力測定。漆酶活力測定參照曹志艷等［18］的方法。在420nm 波長下，連續測定前5min內吸光值的變化，按下式計算漆酶活力。漆酶活力單位定義為1min內，1mL酶液的吸光值變化0.01個單位所需酶量為1個酶活力單位（U）。胞內酶和胞外酶粗酶液制備與測定均3次重復，取平均值。

式中At1表示反應起始時的吸光度，At2表示反應終止時的吸光度，t1表示反應起始時的時間，t2表示反應終止時的時間。

1.2.3 芝麻莖點枯病菌聚甲基半乳糖醛酸酶活性

1.2.3.1 葡萄糖標準曲線的制作

稱取50mg葡萄糖，溶解在50mmol／L HAc-NaAc（pH 5.0）緩沖液中，定容至25mL，配制成2mg／mL葡萄糖母液。分別量取葡萄糖母液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于10mL離心管中，加50mmol／L HAc-NaAc補至1.0mL，配制成濃度梯度為0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mg／mL的標準溶液，然后每管分別加入DNS（3，5-二硝基水楊酸）2.0 mL，于沸水浴中加熱2min進行顯色，取出后于冰浴中迅速冷卻，各加入HAc-NaAc緩沖液2mL，振蕩混勻，在540nm 處測定光吸收值。以1mL HAc-NaAc緩沖液替代替葡萄糖按同樣方法顯色作為空白對照，以葡萄糖含量為橫坐標（x），吸光度為縱坐標（y），繪制標準曲線［20］。

1.2.3.2 聚甲基半乳糖醛酸酶提取與活性測定

聚甲基半乳糖醛酸酶提取與活性測定參照薛蓮等［21］的方法，采用DNS比色法測定PMG 活性。參照病程曲線下面積（AUDPC）方法計算酶活發展曲線下面積（the area under enzyme activity progress curve，AUEAPC，簡稱A值），以每個菌株的A值表示其綜合活性大小，按如下公式計算A值［22-24］：

式中i為酶活測定次數，n為總測定次數，X為酶活，T為測定時間。

2 結果與分析

2.1 芝麻莖點枯病菌漆酶活性

2.1.1 病原菌產漆酶活性檢測

對芝麻莖點枯病菌在含ABTS的PDA平板、含苯胺藍（azure-B）的BM 平板和對照PDA平板上的生長狀況（圖1）的觀察表明，在對照PDA培養基上的9個菌株菌落形態沒有明顯差異，菌落呈圓形向外擴展，氣生菌絲發達，菌落生長迅速，呈放射狀，最初白色、后變為灰色，培養36h左右，在平盤中央形成直徑2cm左右的黑色菌核區域，菌核呈密集的點狀分布，并快速蔓延，由菌核產生的色素把整個平板染成亮黑色，培養50h左右菌絲長滿整個平板；在含有ABTS的PDA培養基上生長時，菌落變成了紫紅色。說明9株莖點枯病菌分泌的漆酶氧化了培養基中的ABTS，并且隨著培養時間的延長，9株菌的顯色直徑不斷增大，顏色也不斷加深；9個菌株對培養基上的苯胺藍也具有不同程度的脫色作用，說明芝麻莖點枯病菌不僅能夠產生漆酶，而且都具有不同程度的降解木質素的能力。09-47由于氣生菌絲比較發達，濃密的灰白色氣生菌絲掩蓋了其下的顏色變化。

圖1 平板顯色反應法檢測芝麻莖點枯病菌漆酶活力Fig.1 Laccase activity in Macrophomina phaseolina determined by plate color reaction

2.1.2 漆酶活性測定

細胞內和細胞外漆酶活性測定結果表明，9株芝麻莖點枯病菌胞內、胞外均有漆酶活性。菌株09-54和2010030胞內漆酶活性低于胞外漆酶活性，其余7株菌胞內漆酶活性均明顯高于胞外漆酶活性（表2）。9個菌株中，2010003的胞外酶活力最高，為14.12U／mL；2010028胞內漆酶活性最高，為71.89U／mL，約是其胞外酶活力的13倍。漆酶只有分泌到細胞外才能與作物木質素接觸，因此，胞外酶活性的大小與病原菌致病力的大小密切相關，推測菌株2010003侵染芝麻時降解木質素能力最強。

2.2 聚甲基半乳糖醛酸酶活性測定

試驗得出葡萄糖標準曲線為x＝（y＋0.100 2）／0.724 2（r2＝0.999 2），根據標準曲線計算PMG 酶活。芝麻莖點枯病菌在活體外均能產生可降解果膠的細胞壁降解酶PMG（圖2），在10d內對9株病原菌進行5 次酶活性測定均能檢測到PMG 活性，表明在培養過程中病原菌可持續產生果膠酶。菌株2010028、2010077第2天酶活最高；09-54第6天酶活最高；09-26、09-38、2010003、2010004、2010030第8天酶活最高；09-47第10天酶活最高。以AUEAPC為評價指標進行比較（表3），菌株2010003A值最高，極顯著地高于其他菌株，菌株09-26的A值最低。A值在一定程度上反映了不同菌株PMG綜合活性的大小，也反映了不同菌株降解果膠能力的強弱，進一步推測菌株2010003降解果膠能力最強。

表2 芝麻莖點枯病菌胞內酶、胞外酶差異顯著性分析1）Table 2 Analysis of the significant differences of endoenzymes and extracellular enzymes in Macrophomina phaseolina

圖2 不同芝麻莖點枯病菌菌株聚甲基半乳糖醛酸酶活性Fig.2 PMG activity comparison between Macrophomina phaseolina strains

表3 不同芝麻莖點枯病菌菌株聚甲基半乳糖醛酸酶的AUEAPCTable 3 The PMG AUEAPC value of Macrophomina phaseolina strains

3 討論

研究表明9株M.phaseolina菌株均能檢測到漆酶活性和PMG 活性，推測這兩種酶可能在莖點枯病菌致病過程中起重要作用。M.phaseolina不同菌株之間漆酶活性存在明顯差異，并且同一菌株其胞內和胞外的酶活力差異也比較明顯。真菌中的漆酶常以同工酶的形式存在［25］。研究中所用培養基組成和培養條件一致，所以9株病原菌產漆酶的水平取決于菌株本身的生長特征和代謝狀況，可能其胞內酶與胞外酶的結構不同，因此在致病過程中所起作用也不同。芝麻莖點枯病菌產生果膠降解酶PMG 機制復雜，不但受果膠的誘導，而且還與其上游一系列基因的表達量、調控序列及環境因子等因素有關。只有細胞壁降解酶在寄主體內積累到一定量才會有致病作用，PMG 活性高峰在不同菌株中出現的時間不同，可能會影響病菌侵入寄主的時間。M.phaseolina對芝麻的致病過程是一個復雜的過程，除能產生PMG 和漆酶之外，還會產生其他胞壁降解酶，例如纖維素降解酶，另外還有毒素和激素等致病因子的存在。本研究證實了M.phaseolina能產生漆酶和PMG，菌株2010003胞外漆酶活性以及PMG 的A值均最高。為進一步研究其在寄主活體內的酶活和致病機制奠定了基礎。

［1］Singleton L L，Mihail J D，Rush C M.Methods for research on soilborne phytopathogenic fungi［M］.St.Paul：American Phytopathological Society Press，1992：134-136.

［2］Short G E，Wyllie T D，Bristow P R.Survival ofMacrophomina phaseolinain soil and residue of soybeans［J］.Phytopathology，1980，70：13-17.

［3］Beckman C H.The nature of wilt diseases of plants［M］.St.Paul：American Phytopathological Society Press，1987：175.

［4］Aro N，Pakula T，Penttil M.Transcriptional regulation of plant cell wall degradation by filamentous fungi［J］.FEMS Microbiology Reviews，2005，29（4）：719-739.

［5］An H J，Lurie S，Greve L C，et al.Determination of pathogenrelated enzyme action by mass spectrometry analysis of pectin breakdown products of plant cell walls［J］.Analytical Biochemistry，2005，338（1）：71-82.

［6］Bonugli-Santos R C，Durrant L R，de Silva M，et al.Production of laccase，manganese peroxidase and lignin peroxidase by Brazilian marine-derived fungi［J］.Enzyme and Microbial Technology，2010，46（1）：32-37.

［7］Choi G H，Larson T G，Nuss D L.Molecular analysis of the laccase gene from the chestnut blight fungus and selective suppression of its expression on isogenic hypovirulent strain［J］.Molecular Plant-Microbe Interactions，1992，5（2）：119-128.

［8］Castro-Sowinski S，Martinez-Drets G，Okon Y.Laccase activity in melanin-producing strains ofSinorhizobiummeliloti［J］.FEMS Microbiology Letters，2002，209（1）：119-125.

［9］Zhu Xudong，Gibbons J，Zhang Shirong，et al.Copper-mediated reversal of defective laccase in aDeltavph1avirulent mutant ofCryptococcusneoformans［J］.Molecular Microbiology，2003，47（4）：1007-1014.

［10］Islam Md S，Haque Md S，Islam M M，et al.Tools to kills：Genome of one of the most destructive plant pathogenic fungiMacrophominaphaseolina［J］.BMC Genomics，2012，13：493.

［11］馮晶，高增貴，薛春生，等.玉米彎孢霉葉斑病菌產生的細胞壁降解酶的致病作用研究［J］.雜糧作物，2002，22（3）：164-166.

［12］陳夕軍，張紅，徐敬友，等.水稻紋枯病菌胞壁降解酶的產生及致病作用［J］.江蘇農業科學，2006，22（1）：24-28.

［13］陳兵，王坤元，董國強，等.水稻紋枯病菌的致病性與酶活力的關系［J］.浙江農業學報，1992，23（1）：19-22.

［14］Pratt R G.A direct observation technique for evaluating sclerotium germination byMacrophominaphaseolinaand effects of biocontrol materials on survival of sclerotia in soil［J］.Mycopathologia，2006，162（2）：121-131.

［15］Pecina V，Alvarado M D，Alanis H W，et al.Detection of double-stranded RNA inMacrophominaphaseolina［J］.Mycologia，2000，92（5）：900-907.

［16］Jana T，Sharma T R，Singh N K et al.SSR-based detection of genetic variability in the charcoal root rot pathogenMacrophomina phaseolina［J］.Mycological Research，2005，109：81-86.

［17］Suriachandraselvan M，Seetharaman K.Survival ofMacrophominaphaseolina，the causal agent of charcoal rot of sunflower in soil、seed and plant debris［J］.Journal of Mycology and Plant Pathology，2000，30（3）：402-405.

［18］曹志艷，藏金萍，賈慧，等.玉米大斑病菌漆酶活性測定及基因片段的克?。跩］.華北農學報，2011，26（2）：76-80.

［19］Shin K S，Lee Y J.Purification and characterization of a new member of the laccase family from the white-rot basidiomyceteCoriolushirsutus［J］.Archives of Biochemistry and Biophysics，2000，384（1）：109-115.

［20］方中達.植病研究方法［M］.北京：中國農業出版社，1998.

［21］薛蓮，檀根甲，徐先松，等.蘋果炭疽病菌對蘋果果實致病機制初探［J］.安徽農業大學學報，2006，33（4）：522-525.

［22］倪小文，閻俊，陳新民，等.魯麥21慢白粉病抗性基因數目和遺傳力分析［J］.作物學報，2008，34（8）：1317-1322.

［23］劉喜存，劉紅彥，倪云霞，等.不同化學誘抗劑對金銀花葉片防御酶系的影響［J］.植物保護，2009，35（2）：75-77.

［24］王錫鋒，張忠山，劉紅彥，等.河南農家小麥品種資源抗、慢白粉病性鑒定［J］.河南農業大學學報，1996，30（2）：160-163，174.

［25］Kumar S V S，Phale P S，Durani S，et al.Combined sequence and structure analysis of the fungal laccase family［J］.Biotechnology and Bioengineering，2003，83（4）：386-394.