轉(zhuǎn)基因抗除草劑油菜雜種優(yōu)勢利用系統(tǒng)研究Ⅰ.轉(zhuǎn)基因雄性不育系15A選育

陳社員，官春云，劉忠松，官 梅，鄔賢夢，譚太龍，張振乾，肖 鋼，陳 浩，楊 倩

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，長沙 410128)

轉(zhuǎn)基因抗除草劑油菜雜種優(yōu)勢利用系統(tǒng)研究Ⅰ.轉(zhuǎn)基因雄性不育系15A選育

陳社員，官春云，劉忠松，官 梅，鄔賢夢，譚太龍，張振乾，肖 鋼，陳 浩，楊 倩

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，長沙 410128)

利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將不育基因barnase導(dǎo)入到甘藍油菜湘油15號中，通過多代回交選育，獲得遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因雄性不育系15A。該不育系不育徹底且不受溫度變化影響，除不育性狀外，其他性狀與湘油15號無明顯差異。

油菜；雄性不育系；轉(zhuǎn)基因；育種

植物雄性不育及恢復(fù)的機理通過分子生物學(xué)的深入研究得以破解。現(xiàn)今，科學(xué)家已能利用基因工程技術(shù)獲得完全不同于傳統(tǒng)的全新植物雄性不育雜種優(yōu)勢利用系統(tǒng)[1]。1990年，Mariani等利用TA29啟動子和核糖核酸水解酶基因barnase構(gòu)建了在花藥絨氈層特異表達的不育嵌合基因[2]，同時，利用TA29啟動子和該基因的抑制蛋白基因barstar構(gòu)建恢復(fù)嵌合基因[3，4]，以抗草丁膦除草劑的bar基因作篩選標志，經(jīng)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化獲得了轉(zhuǎn)基因油菜雄性不育和恢復(fù)植株。此后，該不育和恢復(fù)基因被導(dǎo)入多種植物中[2，5～10]，但發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入不育基因的不育植株在較高溫度時育性變化很大，有些不育植株甚至在高溫時育性恢復(fù)，因此這些材料很難得到實際利用。為克服這一現(xiàn)象，李文彬等將TA29與35S啟動子和類黃酮合成酶基因啟動子中的antherbox序列串聯(lián)，以提高TA29的起動效率，調(diào)節(jié)35S啟動子在花藥中的特異表達，設(shè)計出了antherbox- CaMV35S-TA29，再與barnase基因融合構(gòu)建成不育基因，將其導(dǎo)入擬南芥中，獲得了穩(wěn)定的雄性不育植株[11]。目前，國內(nèi)此類研究多局限于導(dǎo)入基因轉(zhuǎn)化植株的基礎(chǔ)研究，沒有育成作物轉(zhuǎn)基因雄性不育系和恢復(fù)系的報道，而PGS(Plant Genetic System)公司已成功實現(xiàn)該系統(tǒng)雜交油菜在加拿大的大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用[12]。湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)利用李文彬等提供的利用TA29-barnase構(gòu)建的嵌合基因質(zhì)粒pBI-TBS-bar及根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumturmefaciens)LBA4404，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法轉(zhuǎn)化甘藍型油菜優(yōu)良品種湘油15號，獲得了轉(zhuǎn)基因雄性不育植株[13]。經(jīng)多年選擇，育成了性狀穩(wěn)定的抗滅生性除草劑草胺丁膦(PPT)的基因工程油菜雄性不育系15A，同時對其結(jié)實特性[14]、生化特性[15]、菌核病抗性[16]等進行了研究。本文主要介紹該不育系的選育過程及特征特性。

1 15A的選育過程

2000年，將李文彬等提供的含有不育基因的TA29-barnase嵌合基因質(zhì)粒pBI-TBS-bar及根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumturmefaciens)LBA4404，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化湘油15號，獲得轉(zhuǎn)基因抗滅生性除草劑草胺膦(PPT)雄性不育株，表現(xiàn)為雄蕊退化、花藥褐黃空癟、無花粉。不育株再用湘油15號回交，回交后代選生長正常、不育性性狀好的植株不斷與湘油15號回交，至2003年獲得除不育性狀外，其他性狀與湘油15號基本一致的轉(zhuǎn)基因不育材料15A。2003年經(jīng)國家轉(zhuǎn)基因辦批準，對該材料進行了3年的中間試驗，2006年又進行了第2個2年中間試驗。以后該不育材料經(jīng)不斷回交保持、選擇，形成了穩(wěn)定的基因工程不育系15A。

2 15A不育特性

2.1 15A田間不育株比例

多年觀察發(fā)現(xiàn)，15A田間不育株與可育株分離比例完全符合1∶1比例(表1)，與通常的隱性核不育系田間不育株比例完全相同。若在苗期噴施1% PPT，死亡的植株數(shù)與存活的植株比例為1∶1。存活的植株在花期調(diào)查，除2%左右的植株可育外，其余均為不育株，說明存活的不育植株帶有不育基因barnase和抗PPT的bar基因，同時說明15A中導(dǎo)入的barnase-bar基因為單考貝，而可被PPT殺死的植株體內(nèi)不帶有barnase-bar基因(圖1，封三)。

表1 15A田間育性分離情況

2.2 15A花器形態(tài)

15A的花器外觀與一般油菜沒有明顯區(qū)別，比原始親本湘油15號的花稍小(表2)，雄蕊在開花初期完全退化(圖2， 封三)，到開花中后期則出現(xiàn)未完全退化的雄蕊，雌蕊完全正常，柱頭不彎曲，蜜腺正常(圖3，封三)。

表2 轉(zhuǎn)基因油菜與非轉(zhuǎn)基因油菜花器形態(tài)比較(mm，2005)

2.3 15A花粉活力檢測

15A整個花期外觀看不到花粉，取花藥壓碎用甲烯藍染色，中后期有極小量的可染成藍色的敗育花粉粒(圖4，封三)。

2.4 15A田間結(jié)果能力

同等條件下種植，比較15A和湘油15號的植株花蕾數(shù)、總花數(shù)、總果數(shù)、結(jié)果率及種子顏色，兩者沒有明顯差異(表3)。

表3 15A和湘油15號結(jié)果能力比較(2004～2006)

花期對15A進行多年自交套袋觀察，在215個套袋單株(約20多萬朵花)中，沒有發(fā)現(xiàn)一粒自交結(jié)實的種子(圖5，封三)，說明15A整個花期均完全不育。但其異交結(jié)實與一般油菜沒有區(qū)別：無論是人工授粉套袋，還是自然授粉，其結(jié)果均完全正常。

3 15A主要特征特性

3.1 生育期

15A的出苗期、終花期、成熟期等各生育階段以及全生育期與原始親本湘油15號無明顯差異，說明導(dǎo)入基因后經(jīng)多代回交，沒有引起生育期明顯變化(表4)。

表4 15A與湘油15號生育期比較

3.2 5葉期葉片性狀

5葉期，轉(zhuǎn)基因油菜15A與其原始親本植株比，植株的葉形、葉毛、葉缺及葉片大小等沒有明顯差異，說明導(dǎo)入基因沒有影響植株的基本性狀。在葉色方面，5葉期前，15A葉色比原始親本稍綠，葉綠素含量稍高(表5)。

表5 15A與湘油15號5葉期葉片性狀比較 (2005-11-08)

3.3 越冬期葉片性狀

越冬期觀察，15A和其原始親本植株葉片主要性狀沒有明顯區(qū)別(表6)，說明外源基因的導(dǎo)入沒有引起油菜越冬期植株性狀發(fā)生明顯變化(表6)。

表6 15A與湘油15號越冬期植株性狀(2005-12-25)

3.4 成熟期主要經(jīng)濟性狀

成熟期15A及原始親本湘油15號的株高、一次有效分枝數(shù)、二次有效分枝數(shù)、單株角果數(shù)、每果粒數(shù)、千粒重等農(nóng)藝性狀沒有明顯差異(表7)。

表7 15A與湘油15號農(nóng)藝性狀比較(2005-05-06)

3.5 品質(zhì)性狀

對15A與原始親本的種子含油量、芥酸和硫苷含量進行檢測，兩者品質(zhì)性狀沒有明顯差異。

表8 15A與湘油15號品質(zhì)性狀比較(2006)

4 討論

(1)15A是將不育基因barnase導(dǎo)入優(yōu)質(zhì)油菜湘油15號中，再用湘油15號不斷回交保持育成的不育系，其主要特征特性除不育性狀外，其他性狀基本與原始親本湘油15號相同。

(2)15A的不育特性只能由含有barstar恢復(fù)基因的油菜恢復(fù)，不含該基因的油菜均是該不育系的保持系。

(3)15A田間噴施PPT后有極少量的可育株(2%左右)，這些植株帶有bar基因，但為什么可育尚需進一步研究。

[1] 官春云，李 栒，李文彬.蕓薹屬植物的生物工程[M].長沙：湖南科學(xué)技術(shù)出版社，1999.

[2] 李勝國，劉玉樂，康良儀，等.煙草花藥特異啟動子的克隆、活性測定及雄性不育基因的構(gòu)建[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，1995，3(3)：25-32.

[3] Mariani C，De Deuckeleer M，Truettner J.Induction of male sterility in plants by a chimaericRibonucleasegene[J].Nature，1990，347(25)：737-741.

[4] Mariani C，Gossele V，De Deuckeleer M.A chimaeric ribonuclease-inhibitor gene restorer feterlity to male-sterility plants[J].Nature，1992，357(4)：384-387.

[5] 曹光誠，孫如勇，陳占寬，等.人工雄性不育基因和恢復(fù)基因的克隆及構(gòu)建研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，1996，29(3)：20-26.

[6] 彭仁旺，周雪榮，周奕華，等.煙草花藥特異表達啟動子的克隆和序列分析[J].生物工程學(xué)報，1996，12：247-250.

[7] 彭仁旺，周雪榮，王峻嶺，等.表達Barstar基因及bar基因的轉(zhuǎn)基因油菜的研究[J].遺傳學(xué)報，1998，25(1)：74-79.

[8] 李勝國，劉玉樂，朱 鋒，等.基因工程雄性不育煙草及其溫度敏感性[J].植物學(xué)報，1997，39(3)：231-235.

[9] 陳 潛，汪迎春，張利明，等.花藥特異嵌合啟動子的構(gòu)建及雄性不育轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2001，9(1)：62-64.

[10] 陳銀華，張廣平.雄性不育基因barnase對西瓜的遺傳轉(zhuǎn)化[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2006，32(4)：128-130.

[11]李文彬，汪迎春，張利明，等.芽孢桿菌核糖核酸酶基因植物花藥特異性表達載體[P].中國專利：CN 1234447，1999-11-10.

[12]張云珍.加拿大轉(zhuǎn)基因油菜商業(yè)化進展及現(xiàn)狀分析[J].世界農(nóng)業(yè)，2011(10)：74-76.

[13]何業(yè)華，熊興華，官春云，等.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)TA29-barnase基因轉(zhuǎn)化甘藍型油菜的研究[J].作物學(xué)報，2003，29(4)：615-620.

[14]龔 莉，王國槐，官春云，等.轉(zhuǎn)基因油菜雄性不育系15A生化特性研究[J].作物研究，2005，19(3)：185-188.

[15]王國槐，龔 莉，官春云，等.轉(zhuǎn)基因油菜雄性不育系15A結(jié)實性研究[J].種子，2006，25 (1)：54-55.

[16]龔 莉，王國槐，官春云，等.轉(zhuǎn)基因油菜雄性不育系15A及恢復(fù)系菌核病抗性研究[J].安慶師范學(xué)院學(xué)報，2008，14 (2)：57-59.

A Transgenic Herbicide-resistant System for Utilization of Heterosis in Rapeseed (Brassicanapus)Ⅰ.Breeding of A Transgenic Male-sterile Line 15A

CHEN She-yuan，GUAN Chun-yun，LIU Zhong-song，GUAN Mei，WU Xian-meng， TAN Tai-long，ZHANG Zheng-qian，XIAO Gang，CHEN Hao，YANG Qian

(Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China)

The successive backcrossing was used to develop a transgenic male-sterile line 15A after introduction of the male-sterility-causing genebarnaseinto the cultivar Xiangyou 15 by genetic transformation.This male-sterile line showed a complete male sterility，with no influence of temperature fluctuation on its fertility.For agronomical characters，the male-sterile line is comparable to its receptor parent Xiangyou 15.

rapeseed; male-sterile line; transgenesis；breeding

2015-01-06

陳社員(1956-)，男，湖南祁東縣人，研究員，主要從事油菜育種工作。

南方糧油作物協(xié)同創(chuàng)新中心項目(2012AA101107；2011AA10A10406)。

S565.4035.3

A

1001-5280(2015)02-0128-04

10.3969/j.issn.1001-5280.2015.02.04