菰黑粉菌轉錄調節因子Rbf1的克隆及表達分析

胡鵬，張雅芬，崔海峰，俞曉平，葉子弘

（中國計量學院生命科學學院/浙江省生物計量及檢驗檢疫技術重點實驗室，杭州，310018）

菰黑粉菌轉錄調節因子Rbf1的克隆及表達分析

胡鵬，張雅芬，崔海峰，俞曉平，葉子弘

（中國計量學院生命科學學院/浙江省生物計量及檢驗檢疫技術重點實驗室，杭州，310018）

為研究菰黑粉菌的形態轉換機制及灰茭形成機理，利用菰黑粉菌的轉錄組數據，分別從正常茭白中的菰黑粉菌（MT型）和灰茭中的菰黑粉菌（T型）中擴增得到Rbf1基因及開放閱讀框序列。結果表明，2種菰黑粉菌的Rbf1基因序列相同，開放閱讀框全長為1 281 bp，無內含子，NCBI中blast及進化分析表明，菰黑粉菌Rbf1基因與玉米黑粉菌具有較高的同源性；另外，菰黑粉菌不同生長階段的Rbf1基因的表達量檢測結果發現，Rbf1基因在菌絲生長前后表達量有顯著差異，在菌絲生長12 h后表達量明顯升高，表明Rbf1基因在菰黑粉菌的菌絲形成及生長過程中具有重要作用。

菰黑粉菌；Rbf1轉錄因子；菌絲生長

茭白（Zizanialatifolia），又稱菰、茭筍、茭白草，為禾本科菰屬多年生宿根草本植物，是原產于我國的一種重要水生蔬菜[1]。研究表明，茭白營養豐富，含有多種營養物質，其蛋白質功效高于面粉、大米和大豆，具有很高的食用價值[2]。此外，茭白還具有很高的藥用價值，有研究表明，從茭白中提取出來的一種分子式為C31H54NaO3的白色晶體，能有效抑制成骨細胞的反常增殖，可用于預防骨質疏松癥[3]。目前茭白廣泛種植于亞洲各地，我國的種植面積也逐年增加。目前的研究認為，茭白的產生與茭白植株內的菰黑粉菌（Ustilagoesculenta）的侵染互作存在較大的關系[4]。菰黑粉菌侵染茭白成功后，茭白開花受到抑制，刺激茭白莖部膨大，形成可食用的膨大莖，并且組織切片觀察發現正常茭白膨大莖部存在著大量的菰黑粉菌，此外在茭白地下莖、葉鞘和芽的維管束組織和薄壁組織也觀察到菰黑粉菌的分布[5，6]。田間種植發現，除可食用的正常茭白外，通常也會發現大量的不可食用的灰茭。灰茭的膨大莖中充滿黑色孢子，誤食可能會造成過敏反應[7]，因此灰茭產生會對茭白的種植造成較大的經濟損失。

菰黑粉菌是黑粉菌目黑粉菌科真菌，進化分析表明，其與玉米瘤黑粉菌（Ustilago maydis）及玉米絲黑穗菌（Sporisorium reilianum）具有較高的親緣關系，是一種典型的二型態真菌，存在菌絲型及酵母型兩種形態，其形態轉換及致病性與多種轉錄調節因子有關。Heimel等[8]研究發現，玉米黑粉菌中轉錄因子Rbf是玉米黑粉菌的侵染過程中主要調節因子，Rbf1基因缺失后，玉米黑粉菌能夠形成菌絲，但是不能產生附著孢，導致其侵染性下降。另外，研究表明，在玉米黑粉菌由酵母型形成菌絲型后，Rbf1基因能夠調節Kpp6、Hdp1、Hdp2、Biz1等基因的表達從而調控細胞周期，控制真菌的生長及附著孢形成等多個致病過程[9]。在侵入植物表皮后，Rbf1能夠與Clp1形成復合物，從而調節信息素mfa及受體pra的表達，進而調節菌絲的形成。

目前認為在正常茭中菰黑粉菌通常以菌絲型形態存在，稱之為MT型，而灰茭中則主要以酵母型形態存在，稱為T型[10，11]。本課題組前期分別從龍茭2號正常茭和灰茭中分離得到MT型和T型菰黑粉菌。以MT型菰黑粉菌的轉錄組數據為基礎設計基因特異引物，分別從MT型及T型黑粉菌中擴增得到Rbf1基因，并對其進行相應的序列分析。利用Real-time PCR技術檢測Rbf1基因在不同形態及不同培養時期的相對表達量，結果表明Rbf1基因的表達與菰黑粉菌形態轉換之間存在一定的關系。以上研究結果為進一步研究菰黑粉菌的形態轉換機制及灰茭形成機理提供了一定理論基礎。

1 材料方法

1.1 試驗材料

①菌株 分離自龍茭2號MT型菰黑粉菌，分離自龍茭2號灰茭的T型菰黑粉菌。

②主要試劑和儀器 SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒（生工），pMD19-T Vector（TaKaRa），RNAiso plus（TaKaRa），LA Taq（TaKaRa），PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa），PrimeScriptRT regent Kit With gDNA Eraser反轉錄試劑盒（TaKaRa），熒光定量試劑盒（TaKaRa）；普通PCR儀（Bio-Rad），核酸電泳儀（Bio-Rad），Gene Genius Bio Imaging System凝膠成像系統，StepOneTMReal-Time PCR System（ABI），光學顯微鏡（LEICAI DMI4000B）。

③培養基 YEPS培養基：蛋白胨 20 g、酵母粉10 g、蔗糖20 g、瓊脂15 g，加水至1 000 mL，分裝后高壓蒸汽滅菌。

1.2 Rbf1基因的克隆

①菰黑粉菌Rbf1基因組序列的克隆 通過CTAB法對MT型菰黑粉菌及T型菰黑粉菌進行總DNA提取，利用特異引物對菰黑粉菌基因組DNA進行PCR擴增，獲得其基因組相應序列，經克隆測序驗證。

②菰黑粉菌總RNA的提取 分別收集MT型和T型菌絲型及酵母型菰黑粉菌，在液氮中充分研磨成粉末，根據提取說明書提取菰黑粉菌總RNA。

③Rbf1基因開放閱讀框的擴增 采用Prime-ScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒合成菰黑粉菌總RNA的cDNA第一鏈。同時根據MT型菰黑粉菌的轉錄組測序結果設計引物（表1），采用普通PCR擴增菰黑粉菌中Rbf基因，經割膠回收后，連接轉化大腸桿菌JM109，菌液驗證，挑取陽性克隆進行測序驗證。分析其結構，并比較分析其與玉米瘤黑粉菌等進化關系。

1.3 Rbf1基因表達模式分析

①樣品采集觀察。以YEPS培養基活化、培養菰黑粉菌，待OD600為0.8～1.0時接種于YEPS固體培養基，28℃培養。觀察培養過程中的菌落形態變化，分別收集培養0、12、24、36、48、60、72、84h后的菌體。3次重復，菌體收集后-80℃保存備用。

②熒光實時定量PCR檢測基因的相對表達量。菰黑粉菌總 RNA的提取同 1.2，利用PrimeScriptRT regent Kit With gDNA Eraser反轉錄試劑盒反轉錄得到cDNA。利用獲得的Rbf1 cDNA序列，按照qRT-PCR引物設計要求設計熒光特異性引物（表1）。以β-actin基因作為內參基因，以不同培養時期的cDNA為模板進行定量PCR擴增。熒光定量PCR采用SYBRGreenI染料法，反應在StepOneTMReal-Time PCR System（ABI）檢測系統上進行。Realtime PCR反應液體系：qPCR反應體系（25 μL）為：Premix Ex TaqTM（2×）12.5 μL，PCR正向引物（10 μmol/ L）1 μL，PCR反向引物（10 μmol/L）1 μL，ddH2O 9.5 μL，cDNA1.0μL。反應程序為95℃30s；95℃30s，60℃15s，72℃延伸30s，進行40個循環，每個反應設置3個重復樣品。熒光定量所得Ct值采用2-△△Ct法進行分析[12]。

2 結果與分析

2.1 菰黑粉菌Rbf1基因克隆及序列結構分析

根據轉錄組測序結果，實驗設計了針對Rbf1基因的開放閱讀框（ORF）的引物，分別提取MT型菰黑粉菌和T型菰黑粉菌RNA，反轉錄為cDNA，擴增得到相應的Rbf1基因的ORF序列，對兩種菰黑粉菌的Rbf1序列進行比較分析。測序結果表明，兩種菰黑粉菌中的Rbf1具有相同的ORF序列，其ORF共1281bp，編碼426個氨基酸，理論分子量為109.59KDa，理論等電點為4.94。利用其編碼序列，通過MegAlign軟件采用近鄰法構建系統進化樹（圖1A），結果表明，菰黑粉菌與玉米瘤黑粉菌及玉米絲黑穗菌具有較高的親緣關系，可能具有類似的功能。

對菰黑粉菌Rbf1基因組序列進行PCR擴增后得到1281bp的基因組序列。通過NCBI中的Spidey程序將該基因組序列與Rbf1cDNA序列進行比對分析，發現其不含內含子。Rbf1包含一個保守結構域，編碼一個核酸結合位點，同時編碼一個鋅指結構域（圖1B）。

2.2 菰黑粉菌Rbf1基因表達差異分析

實驗以YEPS分別培養T型菰黑粉菌及MT型菰黑粉菌，每隔12h觀察生長狀況及菌落形態，同時收集相應的菌體，-80℃保存。顯微觀察結果表明，T型菰黑粉菌在培養36h后開始產生明顯菌絲（圖2A），48 h后菌絲大量生長（圖2B）；MT型菰黑粉菌則在培養60 h后產生菌絲（圖2C），72 h后菌絲大量生長（圖2D）。提取不同時間段的菰黑粉菌RNA，并反轉錄為cDNA，通過實時定量PCR檢測在不同培養時間段Rbf1基因的相對表達量。結果表明，T型菰黑粉菌在培養48 h后，Rbf1基因的表達量達到最大，而MT型菰黑粉菌則在72 h后表達量最大，2種黑粉菌均在菌絲生長12 h后達到最大表達量（圖3）。

3 討論與結論

目前的研究表明，菰黑粉菌在茭白孕茭的過程中發揮著重要作用。研究發現，在茭白孕茭的早期階段，菰黑粉菌較少，其菌絲的大量增殖可能與茭白膨大密切相關[5]。 進化分析表明，菰黑粉菌與玉米黑粉菌具有較高的親緣關系，因此推測菰黑粉菌對茭白的侵染機制可能與玉米黑粉菌相似，都必須由酵母型形態轉換為菌絲型形態，進而侵入植物表皮細胞，獲取營養。在玉米黑粉菌的侵染過程中，菌絲的生長主要由信息素及信息素受體系統調節；而在菌絲生長后，Rbf1基因大量表達調控下游基因Biz1、Hap1等，進而調節附著胞的形成及對植物表皮的穿透，完成整個侵染過程。同時，Rbf1能夠與Clp1、Cib1基因結合形成復合物，反饋調節信息素的表達，影響菌絲的形成[13]。

本試驗在轉錄組測序的基礎上，通過PCR擴增得到T型和MT型菰黑粉菌的Rbf1基因組序列及RNA序列，并對其基本特點進行分析，明確其基本結構。同時實驗結果表明，Rbf1因子的表達與菰黑粉菌的菌絲生長有一定的關聯。無論是T型菰黑粉菌還是MT型菰黑粉菌，在培養初期菌絲形成階段，Rbf1基因一直處于低表達水平，沒有明顯的變化；菌絲形成后12 h，T型菰黑粉菌與MT型菰黑粉菌中Rbf1因子的表達量均顯著上調，隨后逐步下降。因此，與玉米黑粉菌類似，菰黑粉菌中Rbf1基因在菌絲的形成及快速生長過程中起著重要作用，可能與玉米黑粉菌類似，參與反饋調節信息素的表達。

在本實驗的基礎上，后續可進一步篩選可能的與其相互作用的其他基因，同時可通過基因敲除及回補深入研究Rbf1基因在菰黑粉菌菌絲生長及對茭白的侵染作用，為闡明茭白的孕茭機制提供理論基礎。

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Cloning and Expression Analysis of Transcription FactorRbf1fromUstilago esculenta

HU Peng,ZHANG Yafen,CUI Haifeng,YU Xiaoping,YE Zihong
(College of Life Sciences,China Jiliang University,Zhejiang Provincial Key Laboratory of Biometrology and Inspection&Quarantine,Hangzhou,Zhejiang 310018,China)

For the study ofUstilago esculentamorphological transformation mechanism and formation mechanism of grey Jiaobai，theRbf1gene was cloned in twoU.esculentastrains isolated from white Jiaobai(MT-type)and grey Jiaobai(T-type),based on analysis of the genome and transcriptome sequencing data.Sequence analysis results indicated that the Rbf1gene sequence was conservative in the two strains,with the open reading frame(ORF)of 1 281 bp without intron. The NCBI blast and phylogenetic analysis showed that the Rbf1 had highest homology compared to that inU.maydis.In addition,microscope observation and real-time analysis results showed thatRbf1was up-regulated after the hyphae formed and to be the highest 12 h later,indicating the importance in hyphae formation and growth.

Ustilago esculenta;Transcription factorRbf1;Hyphae growth

S645.2；Q781；Q786

A

1001-3547（2015）22-0198-04

10.3865/j.issn.1001-3547.2015.22.072

浙江省自然科學基金（LQ15C140003）；國家科技支撐計劃項目（2012BAD27B01）；國家自然科學基金項目（3147085）

胡鵬（1990-），男，碩士，研究方向為植物與微生物互作，E-mail：hpq990@163.com.

葉子弘，通信作者，電話：0571-86836062，E-mail：zhye@cjlu.edu.cn

2015-10-14