菰黑粉菌中Ueubc2的克隆及表達分析

余佳佳，張雅芬，崔海峰，俞曉平，葉子弘

（中國計量學院生命科學學院/浙江省生物計量及檢驗檢疫技術重點實驗室，310018）

菰黑粉菌中Ueubc2的克隆及表達分析

余佳佳，張雅芬，崔海峰，俞曉平，葉子弘

（中國計量學院生命科學學院/浙江省生物計量及檢驗檢疫技術重點實驗室，310018）

茭白是我國第二大水生蔬菜，它的形成與其內生真菌菰黑粉菌的侵染密切相關。根據菰黑粉菌轉錄組數據庫設計特異引物，采用RT-PCR擴增獲得Ueubc2基因，序列分析發現Ueubc2是玉米瘤黑粉菌中ubc2的同源基因，編碼蛋白含有SAM、RA、SH3結構域，作用于MAPK信號通路。同時通過實時熒光定量PCR對Ueubc2基因進行表達分析，發現在融合生長過程中Ueubc2上調表達，并在菌絲形成時其表達量最大，隨著菌絲生長表達量逐漸降低，表明其在菰黑粉菌真菌二型態轉變過程中具有重要作用。

菰黑粉菌；二型態轉換；Ueubc2

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本課題組前期分別從龍茭2號正常茭和灰茭中分離得到的菰黑粉菌MT-1、T-1。

1.2 試驗培養基

YEPS培養基：酵母提取物10 g，胰蛋白胨20 g，蔗糖20 g，蒸餾水1 000 mL；固體培養基另加15 g瓊脂；LB培養基：胰蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 10 g；固體培養基另加15 g瓊脂。

1.3 Ueubc2基因片段的擴增

①菰黑粉菌總RNA和DNA提取 收集適量菰黑粉菌，在液氮中充分研磨成粉末，根據Trizol試劑提取說明書提取菰黑粉菌總RNA。DNA提取則用CTAB法。

②Ueubc2基因相關大片段的擴增 根據菰黑粉菌反轉錄數據庫進行信息學分析，得到Ueubc2基因預測片段，根據預測結果設計特異引物Ueubc2-F1和Ueubc2-R1（表1），采用普通PCR以基因組DNA為模板擴增菰黑粉菌中該基因的已知片段，經割膠回收后，通過TA克隆轉化大腸桿菌，挑取陽性克隆，進行測序驗證。經NCBI的BLAST功能檢測，確定該片段包含Ueubc2基因的完整序列，并包括部分上下游基因。

③菰黑粉菌Ueubc2基因組序列的克隆 根據②擴增片段測序結果，設計特異引物Ueubc2-gF和Ueubc2-gR，以DNA為模板擴增Ueubc2基因完整序列，并測序。

④菰黑粉菌Ueubc2 cDNA全長序列的擴增 采用 PrimeScriptRT regent Kit With gDNA Eraser反轉錄試劑盒合成菰黑粉菌總RNA的cDNA第1鏈。根據已擴增片段分析結果，設計引物Ueubc2-F2和Ueubc2-R2擴增目的基因cDNA完整序列，經克隆測序驗證。然后通過NCBI的BLAST功能，同其他已知物種進行氨基酸序列同源性比對，并利用MEGA軟件進行序列分析，用Neighbor-joining方法構建系統發育樹和多重序列比對圖譜，并根據同源性來預測Ueubc2編碼蛋白的功能。

1.4 Ueubc2基因表達模式分析

①樣品采集觀察 以YEPS固體培養基分別培養從龍茭2號正常茭和灰茭中分離得到的菰黑粉菌，先分別在YEPS液體培養基中培養至菌濃度OD600為2.0。以OD600為2.0的菰黑粉菌為初始濃度，分別取100 μL菌液，涂布YEPS固體平板，分別培養0、12、24、36、48、60 h后收集菌體。試驗重復3次，收集的菌體用液氮速凍，-80℃保存。

②熒光實時定量PCR檢測基因的相對表達量

菰黑粉菌總RNA的提取及其cDNA的合成方法同1.2，利用獲得的Ueubc2cDNA序列，按照qRT-PCR引物設計要求設計熒光特異性引物（表1）。以β-actin基因作為內參基因，以YEPS固體培養基上分別培養0、12、24、36、48、60 h的cDNA為模板進行定量 PCR擴增。熒光定量PCR采用SYBR Green I染料法，反應在StepOneTMReal-Time PCR System（ABI）檢測系統上進行。PCR反應液體系為：10 μL SYBR Premix Ex TaqTM，0.5 μL PCR Forward Primer（10 μmol/L），0.5 μL PCR Reverse Primer（10 μmol/L），0.5 μL cDNA模板，8.5 μL PCR水。反應程序為 95℃ 30 s；95℃ 30 s，54℃ 20 s，72℃延伸30 s，進行40個循環，每個反應設置3個重復樣品。根據實時熒光定量PCR得到的Ct值以及標準曲線，采用2-ΔΔCt法計算Ueubc2的相對表達量[20]，同時對其進行顯著性差異分析。

2 結果與分析

2.1 菰黑粉菌Ueubc2基因的全長克隆及序列特征分析

根據前期菰黑粉菌轉錄組數據庫信息，設計了特異引物（表1）擴增了Ueubc2目的基因和開放閱讀框。根據Ueubc2-F1和Ueubc2-R1引物以菰黑粉菌DNA為模板擴增得到4 091 bp（圖1）的序列，對測序結果根據NCBI數據庫中的Blast功能進行信息學分析，確定該序列包含Ueubc2完整序列和部分上下游序列。再根據信息學結果設計引物Ueubc2-gF和Ueubc2-gF，以DNA為模板擴增得到2 562 bp序列（圖1），經Blast功能分析發現該蛋白與玉米瘤黑粉菌中的ubc2基因具有較高的同源性，包括了的TAG終止密碼子和ATG起始密碼子，是完整序列。再以Ueubc2-F2和Ueubc2-R2引物，以cDNA為模板擴增該目的基因的開放閱讀框，得到2 562 bp片段（圖1），而基因組擴增得到的Ueubc2完整序列也是序列2 562 bp，說明該目的基因內部不含內含子。

經ExPasy預測，Ueubc2基因編碼了853個氨基酸，蛋白分子量約為90.42 kDa，理論等電點為8.09。通過NCBI中的BLAST比對結果表明，該序列與其他真菌中的MAPK信號通路調控蛋白具有高度同源性，特別與玉米黑粉菌中的Ubc2蛋白結構很相似，因此我們將其命名為Ueubc2（GenBank登陸號KT779549）。

2.2 Ueubc2蛋白結構及系統發育分析

根據文中2.1獲得的Ueubc2目的基因和開放閱讀框序列測序結果，將基因翻譯成氨基酸序列，使用Blast中蛋白比對功能與NCBI數據庫中所有蛋白進行比對。結果表明，該蛋白具有SAM結構域（sterile alpha motif domain）、RA結構域（ras association domain）和2個SH3結構域（Src homology 3 domain）33種特征結構（圖 2）。而玉米瘤黑粉菌中的Ubc2蛋白也存在這3個結構域，說明我們的Ueubc2與Ubc2蛋白很可能具有相似功能。為了研究Ueubc2與其他真菌中具有相似結構的銜接蛋白進行進化分析，篩選了部分親緣關系較近真菌構建進化樹，如圖3。從圖中可知菰黑粉菌Ueubc2蛋白與大麥堅黑粉菌（Ustilago hordeiCCF49723.1）、玉米瘤黑粉菌（XP_011391983）、玉米絲黑穗病黑粉菌（Sporisorium reilianumCBQ70036）、賓地瘤黑粉菌（Melanopsichium pennsylvanicum4 CDI56086）親緣關系較近。說明Ueubc2蛋白確實與玉米瘤黑粉菌中的Ubc2蛋白屬于同類蛋白。將菰黑粉菌Ueubc2蛋白與以上4種真菌中的MAPK信號途徑中的銜接蛋白進行比對，如圖4。因為比對的蛋白較大，所以就截取了部分比對序列，但從圖中還是可以看出這5種真菌銜接蛋白的結構還是具有一些差異，但SAM（氨基酸位點13-79）、RA（氨基酸位點432-509）、2個SH3（氨基酸位點586-640；737-785）3種結構域在這5種蛋白質中都比較保守，只有少數幾個堿基的差異。表明菰黑粉菌中該蛋白可能是比較重要的蛋白，具有與其他真菌類似的功能，可能也參與真菌的菌絲生長、致病性和有性生殖的過程。

2.3 Ueubc2基因在不同培養時間、菌落形態下的表達特征分析

將菰黑粉菌MT-1、T-1分別培養0、12、24、36、48、60 h后進行菌落顯微觀察，發現培養初期，菰黑粉菌菌落光滑（圖 6C），邊界清晰，培養后，T-1在12 h即可觀察到形成的菌絲（圖 6A），而MT-1在36 h可觀察到形成的菌絲（圖 6D）。收集菌體，通過熒光定量PCR分析Ueubc2的表達量，結果如圖5，T-1茭白黑粉菌中Ueubc2基因表達量在12 h時最大，此時菌落開始生長菌絲；而MT-1茭白黑粉菌中Ueubc2基因表達量在36 h時最大，此時菌落在倒置顯微鏡下可以觀察到菌絲生長，12 h時菌落邊界較光滑（圖 6B）。MT-1、T-1菰黑粉菌中Ueubc2的表達量趨勢基本一致，Ueubc2基因表達量都是呈現先上升后下降的過程，但是在融合生長過程中該基因在T-1菌株中的表達量顯著高于MT-1，同時從圖 6可以看出T-1菰黑粉菌菌絲生長速度較MT-1快，可能與其生長能力相關。對Ueubc2基因在不同培養時間、菌落形態下的表達特征綜合分析，推測Ueubc2基因可能與菰黑粉菌菌株融合和菌絲生長有關。

3 討論與結論

茭白是我國第二大水生蔬菜，不但其本身營養豐富，口感也極佳，廣受人民喜愛，是一種具有較高經濟價值的健康蔬菜[6～8]。但至今茭白植株孕茭機制還不是很清楚，這就迫切需要我們投入更大的精力于茭白孕茭機制的研究。而前期研究已發現菰黑粉菌是茭白植株基部膨大成可食用肉質莖的關鍵，也在茭白組織切片中觀察到黑粉菌，并成功從茭白中分離得到菰黑粉菌，為孕茭機制在基因水平的研究提供了基礎。而菰黑粉菌的侵染能力又與真菌二型態具有密切聯系，菌絲態真菌一般具有侵染宿主的能力[9]，如釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）[9～10]、玉米瘤黑粉菌[11]。而真菌二型態的轉變受cAMP和MAPK信號途徑的協同調控[12～14]，本試驗克隆得到的Ueubc2基因是MAPK信號途徑上游的關鍵基因。結合Ueubc2蛋白結構及親緣關系分析，可知該蛋白是玉米瘤黑粉菌Ubc2的同源蛋白，是MAPK信號通路中的上游基因[14]，Ueubc2基因的缺失，很可能會導致菰黑粉菌致病性的缺失。在玉米瘤黑粉菌Ubc2蛋白中存在3個保守結構域，SAM、RA和2個SH33種結構域（圖2），它們是Ubc2蛋白行使功能不可缺少部分。SAM結構域普遍存在于信號蛋白和核蛋白中，以EPH-相關的酪氨酸激酶介導細胞與細胞間的的信號轉導；RA結構域可能會與RasGTP蛋白結合，是假定的RasGTP效應器。它們參與真菌菌絲的生長，與真菌二型態轉變有關[5]。SH3結構域是蛋白與蛋白間相互聯系的部分，對于富含脯氨酸的序列具有更強的親和性，優先與P×× P基結合。SH3結構域的蛋白具有多樣的細胞作用，比如酶的調節、信號通路調控、介導蛋白復合體的組裝等，是玉米瘤黑粉菌致病性產生的必須成分[5]。而在菰黑粉菌中也存在Ubc2同源蛋白，并且也具有與其高度同源的3個功能結構域。從Ueubc2基因在不同培養時間、菌落形態下的熒光結果可知，Ueubc2基因跟菰黑粉菌菌絲融合生長密切相關，且主要作用于菌絲形成初期，可能與其已知作用機制類似，在菰黑粉菌中，Ueubc2作用于信息素響應，從而啟動MAPK信號途徑來促進菌絲生長[5]。本試驗通過對Ueubc2基因在菰黑粉菌中的表達水平來探索該基因在其二型態轉變過程中的作用，為后期研究菰黑粉菌在茭白植株中菌絲態的形成時期，以及孕茭機制探索提供了實驗基礎。

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Cloning and Expression Analysis ofUeubc2inUstilago esculenta

YU Jiajia,ZHANG Yafen,CUI Haifeng,YU Xiaoping,YE Zihong
(College of Life Sciences,China Metering University;Zhejiang Provincial Key Laboratory of Biometrology and Inspection&Quarantine,Hangzhou,310018)

Zizania latifoliais the second aquatic vegetable in China.Its formation is closely releted the interaction which between its internally Endophytic fungus andUstilago esculenta.According to the transcriptome database ofUstilago esculenta,we designed the specific primers,using RT-PRC to amplify geneUeubc2.Sequence analysis showed that Ueubc2is the homologous gene ofubc2inUstilago maydis,and the encoding protein contains SAM,RA and SH3 domain, which acting on the MAPK signal pathway.At the same time,the expression analysis by real-time PCR revealed to gene Ueubc2was up-regulated during the mating progress,and reached highest when hyphae formed,then decreased during hyphae's growth,the result shows that it had an important role in the process of two type transformation ofUstilago esculenta.

Ustilago esculenta;two type transformation;Ueubc2

S645.2；Q786；Q781

A

1001-3547（2015）22-0202-06

10.3865/j.issn.1001-3547.2015.22.073

國家科技支撐計劃項目（2012BAD27B01）；浙江省公益項目（2014C32022）；國家自然科學基金項目（3147085）

2015-10-14與菰黑粉菌二型態轉變過程。本研究為進一步闡述菰黑粉菌菌絲形態發生的分子機制，探討茭白的孕茭機理提供了理論基礎。

茭白（Zizania latifoliaTurcz），古稱為菰，是禾本科多年水生宿根性草本植物，原產中國及部分東南亞地區[1]。《周禮》中記載在公元前3世紀“菰”為六谷之一，是重要糧食作物[2]。茭白共生菌菰黑粉菌可以侵入茭白植株，使茭白莖基部膨大形成可食用茭白，該種肉質鮮美、營養豐富的膨大組織是我國長江流域以及以南地區廣泛栽培的經濟作物[1]。前期研究也發現在茭白膨大過程中，組織中菰黑粉菌（Ustilago esculenta）會大量增殖，在切片中可以觀察到大量菌絲[3]。因此，菰黑粉菌與茭白的生產密切相關。

菰黑粉菌屬于黑粉菌屬真菌，具有典型的二型態生活史。而真菌的致病性與其二型現象具有緊密聯系，酵母型真菌處于無性生殖狀態，進行芽殖或裂殖；菌絲型的產生一般與真菌的有性生殖有關，該狀態下的真菌具有侵染宿主的能力。菰黑粉菌同樣具有酵母型和菌絲型2種型態，且在茭白膨大過程中菰黑粉菌也隨之快速增殖，菌絲也大量生長，所以菰黑粉菌的侵染能力可能也與其近緣真菌玉米瘤黑粉菌（Ustilago maydis）類似，菌絲態的形成使真菌具有侵染能力[4]。真菌的二型態轉變又與環磷酸腺苷/蛋白激酶A（cAMP/PKA）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase,MAPK）信號途徑相關，它們可以協同調控真菌菌絲的生長，并使真菌產生致病性。在玉米瘤黑粉菌中，MAPK信號途徑可以調控真菌中交配型基因交聯、型態轉變和致病性。MAPK信號通路包含Kpp4/ Ubc4、Fuz7/Ubc5、Kpp2/Ubc3、Kpp6和Crk1。另外，ubc還存在其他2個基因，Ubc1蛋白參與cAMP/ PKA信號途徑中PKA亞基的表達調控；Ubc2銜接蛋白調控信息素響應的MAP激酶信號通路和致病性產生的過程。ubc2基因位于MAPK信號通路最上游位置，ubc2基因發生突變，玉米瘤黑粉菌菌絲生長會受到抑制[5]。

本課題組前期對菰黑粉菌轉錄組進行分析，發現在菰黑粉菌中具有與玉米瘤黑粉菌ubc2基因序列相似基因，因此對本課題組前期分離得到的菰黑粉菌進行該基因序列和開放閱讀框的PCR擴增，通過基因結構、同源性及系統進化分析表明，該基因與玉米瘤黑粉菌中ubc2基因具有較高同源性，故命名為Ueubc2。同時利用熒光定量PCR檢測分析了不同培養時間誘導后Ueubc2在菰黑粉菌菌落二型態轉化過程中的表達情況，發現菰黑粉菌菌落在從酵母型向菌絲型轉化過程中Ueubc2基因的表達量具有明顯的變化，其中在培養早期Ueubc2呈上調表達，并在菌絲開始形成時達到最大，之后隨著菌絲大量形成，表達量逐漸降低，表明該基因參

余佳佳(1990-)，女，研究生，主要從事真菌與植物互作，E-mail：yji12579@163.com

葉子弘，通信作者，電話：0571-86836062，E-mail：zhye@cjlu.edu.cn