水生蔬菜真菌病害識別與病原菌鑒定的實用方法

魏林，梁志懷，張屹，肖姬玲，呂剛，3

（1.湖南省植物保護研究所，長沙，410125；2.湖南省西瓜甜瓜研究所；3.中南大學研究生院隆平分院）

1 水生蔬菜真菌病害癥狀觀察和發病程度調查方法

1.1 癥狀觀察

在田間對目標水生蔬菜真菌病害進行癥狀觀察時，都遵循方中達先生所述的先片后點的原則。即先觀察病害在全田發生的普遍性和嚴重度，病害發生的中心區及在田間發展分布，發生時期以及植株受害部位；然后觀察病害對整個植株的為害情況，包括是否出現腐爛、萎蔫、萎縮、畸形及生長習性的改變等；最后觀察出現典型癥狀的部位。

在針對由真菌所引起的水生蔬菜的葉斑病和斑點病等，調查時除觀察病斑形狀、大小、顏色、受害部分正反面（如葉面及葉背）癥狀、病斑上是否出現霉狀物或小黑點或輪紋等孢子和子實體病征外，還需留意癥狀初始狀態，及至發病后期的癥狀。本文采用的方法是發現初始癥狀后，定點固定幾片葉，掛上標簽。隨后的一段時期，定時定點觀察病害在葉片上癥狀發展情況，這樣做既確定了該病害發生后期的為害癥狀，又獲得了該病害的發生發展規律。

1.2 發病程度調查的分級標準、病原菌致病性等級及品種抗性等級的劃分

在水生蔬菜葉部病害發生程度調查、室內人工接種病原菌測定其致病性和寄主抗病性，以及對水生蔬菜各真菌性葉斑病等病害進行田間藥劑防治試驗時，都需要一個病害調查的分級標準。根據各病害的發生特點，制定了相應的田間葉部病害調查分級標準，室內菌絲塊人工接種時藕塊發病調查分級標準，以及蓮藕腐敗病實生苗人工接種發病調查分級標準。實際應用表明，所制定的分級標準可以很好的區分植株的受害程度，進而鑒定出病原菌菌株間致病性的差異及寄主間抗病性的差異。具體的分級標準如下。

①發病程度調查的分級標準 在田間進行蓮藕葉部病害發生程度及田間藥效防治試驗時，制定的調查葉片發病程度分級標準為：0 級:葉片無病斑；1 級：病斑面積占整片葉面積的10%以下；3 級：病斑面積占整片葉面積的11%～25%；5 級：病斑面積占整片葉面積的26%～50%；7 級：病斑面積占整片葉面積的51%～75%；9 級：病斑面積占整片葉面積的75%以上。

②病原菌致病性等級劃分 在接種新鮮藕塊依據發病藕塊的病情程度來判斷蓮藕腐敗病菌和不同菌株的致病力強弱時，制定的調查藕塊發病程度分級標準為：0 級：藕塊生長正常、完好；1 級：藕塊表面有輕微病變，病變尚未侵及藕塊體內組織；2 級：藕塊組織有明顯病變，維管束呈褐色；3 級：藕塊維管束呈深褐色，病變部分占藕塊總面積的10%以下；4 級：藕塊維管束呈深褐色，病變部分占藕塊總面積的10%～30%；5 級：藕塊維管束呈深褐色，病變部分占藕塊總面積的30%以上，每個藕塊為一計量單位。依據調查分級的結果，計算病情指數：病情指數=∑（各級藕塊數×相對級數值）/（調查總藕塊數×5）×100；再依據病情指數，按如下等級劃分腐敗病病原菌致病力的強弱：病情指數＞70，表示強致病力；30≤病情指數≤70，表示中致病力；病情指數＜30，表示弱致病力；病情指數為0，表示無致病力。

③品種抗性等級劃分 在進行蓮藕腐敗病實生苗人工接種測定品種抗病性時，制定的調查葉片發病程度分級標準為：0 級：植株葉片未見任何發病癥狀；1 級：葉片僅葉緣出現零星病斑，病斑面積不超過葉該葉片總面積的5%；2 級： 病斑沿葉緣連片，并向葉片中心發展，病斑面積占該葉片總面積的5%～20%；3 級：病斑面積占該葉片總面積的21%～40%；4 級：病斑面積占該葉片總面積的41%～60%；5 級：病斑面積占該葉片總面積的61%～80%；6 級：病斑面積占該葉片總面積的81%～100%，葉片褐腐死亡。蓮不同品種對腐敗病的抗性評價根據病情指數分成6 個等級：高抗≤10；10＜抗病≤20；20＜中抗≤40；40＜中感≤60；60＜感病≤80；80＜高感≤100。

2 病原菌菌絲體和子實體直接鏡檢的方法

由病原真菌引起的水生蔬菜病害，在其發病部位會有明顯的病征，可以利用這一點，在田間應用放大鏡、 室內應用顯微鏡在分離病原物前進行檢查，觀察植株發病部位附著的真菌菌絲體和其他營養體的形態和結構、孢子形態和著生方式、子實體形態結構和產生部位等，從而對病原物先有初步的了解。在此過程中，常用的方法有3 種。

①當植株發病部位出現明顯的黑點（孢子體）、菌絲體、菌核等病征時，最簡單的方法就是接種針直接挑取這些特征物，放在加有一滴無菌水的載玻片上，蓋上蓋玻片后即可在顯微鏡下觀察。

②當植株發病部位出現的是如黑粉、白粉和其他霉狀物時，則可以用小片透明膠帶，貼在這些真菌體的部位，然后將沾有真菌的膠帶放在載玻片上，于顯微鏡下觀察。

③對于由鏈格孢或子囊菌等引起的病征十分明顯的病害，還可以用尖細的鑷子撕取透明的小塊受害部位寄主組織，直接放在載玻片上于顯微鏡下觀察。

3 病害病原菌單孢純化培養方法

蓮藕、茭白等水生蔬菜真菌病害的病原菌，在普通的PDA 培養基上的產孢能力均較強。利用這一特點，可以應用簡易的稀釋涂板挑單孢，對目標菌株進行純化。具體操作是：將病組織分離獲得微生物，在PDA 培養基上培養至大量產孢，在無菌條件下，挑取0.5 cm×0.5 cm 的菌絲塊，放置裝有1 mL無菌水的離心管中，搖動片刻后，再吸取100 μL 轉至下一離心管中，然后用稀釋到適宜濃度的離心管中的孢子懸浮液進行PDA 平板涂布，可獲得分離度很好的單孢菌落群。

4 用科赫氏法則驗證病原菌的方法

4.1 病原菌鑒定的回接方法

對病原菌進行確定時，遵循科赫氏法則，需進行回接驗證。回接時的接種方法，因病原菌侵染的部位不同也有所不同。在對蓮藕腐敗病病原菌進行研究時，篩選強致病性菌株時，選取的是新鮮藕塊接種方法：經過分離純化和分子鑒定的供試鐮刀菌菌株用PDA 培養基培養5～6 d，取嫩藕節6～8 cm長的中間段，縱剖切取獲得用于接種的藕塊；用直徑為5～7 mm 無菌打孔器自菌落的邊緣打取菌餅，菌餅置于藕塊的中央，菌絲體面朝下，每個藕塊均勻接種2 個鐮刀菌菌餅，然后將裝有接種藕塊的發芽盒放置于24～26℃恒溫培養箱中進行保濕培養；然后按照1.2 的分級標準進行調查和分級確定。

在篩選蓮抗腐敗病品種研究時，除選用篩選出的強致病性菌株接種菌株外，采用的實生苗蘸根接種，即將破口的蓮籽浸在滅菌水中，24～26℃條件下催芽，每天換水1 次。待蓮籽萌發長出直立的幼葉、生根3～5 條時，接種蓮腐敗病病原菌。蓮腐敗病病原菌在超凈工作臺上按以下操作進行接種：將每條根在距根尖0.5 cm 處剪斷，以造成根系的微傷口，然后將整個根系浸入由無菌水調節的含105～106個孢子/mL 蓮腐敗病病原菌懸浮液中20～40 min。將接種后的實生苗移栽于盆缽中栽培，接種至少20 d后，按照1.2 中所列病害評價等級對葉片進行病害等級鑒定，鑒定后計算病情指數，確定籽蓮品種對腐敗病的抗病性類型。

對于各種葉部病害的接種，比較了孢子懸浮液接種和菌絲塊接種2 種方法后，采用的是菌絲塊接種：先將待接種的健康幼嫩、無任何斑點和褪綠癥狀的盆栽蓮藕葉片接種部位用無菌水擦拭干凈，然后將分離純化的病菌菌絲塊以針刺法接種于該部位，并用蘸水的無菌脫脂棉保濕，一般24 h 后接種部位就可出現不同的表型。

4.2 病原菌再分離方法的簡化

當應用原始菌株接種植物發病后，對發病組織進行致病菌再分離時，因接種發病的病原菌很單一，所以可將發病的小片組織表面消毒后，在無菌條件下制取植株汁液，稀釋適宜倍數后進行PDA平板涂布，然后挑取單孢菌落。

5 病原菌保存的方法

PDA 2～3 月即需轉管一次。礦物油覆蓋保存，雖然保存的菌種存活期較長，通常2～3 a 才需檢查其存活狀態，但該種保存效果與操作技術密切相關，同時當活化菌種用接種針從礦物油下挑取的菌絲體，因其攜帶有礦物油，所以生長較慢，一般要再移植1～2 次才能得到良好的菌種。 所用的方法是用2 mL 的小離心管，挑取在PDA 培養基上培養至產孢0.5 cm×0.5 cm 的2～3 塊菌絲塊置于其中，加無菌水浸沒菌絲塊并高出菌絲塊0.5 cm，然后將離心管放置于4℃左右的冰箱中，使用時只需在無菌條件下，用接種針挑出置于滅菌的濾紙上吸去多余的水分后置于PDA 培養基上活化培養即可。本實驗室用此方法保存的菌株，6 個月以上仍具有很高的活性。