銅綠假單胞菌次生代謝產(chǎn)物的研究進(jìn)展

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128）

研究表明，微生物的生物多樣性遠(yuǎn)比用傳統(tǒng)方法估計(jì)的要廣，但由于受分離培養(yǎng)技術(shù)的局限，目前可培養(yǎng)的微生物僅占自然界存在的0.1%～1%，因此，自然界中有數(shù)以百萬計(jì)的微生物物種等待人們認(rèn)識(shí)、挖掘和利用［1］。自從微生物中提取青霉素以來，人們已經(jīng)從微生物代謝產(chǎn)物中提取出大量的生物活性物質(zhì)，其中銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa，PA）次生代謝產(chǎn)物日益受到人們的關(guān)注。

銅綠假單胞菌在自然界分布廣泛，為土壤中存在的最常見的細(xì)菌之一。銅綠假單胞菌可產(chǎn)生多種活性物質(zhì)，在醫(yī)藥、衛(wèi)生方面的研究報(bào)道最多，其次在防治植物病害方面，可對(duì)多種植物病原真菌和細(xì)菌具有抑制作用。

作者對(duì)銅綠假單胞菌次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行綜述，探討存在的問題及未來的發(fā)展方向，旨在為銅綠假單胞菌次生代謝產(chǎn)物的科學(xué)研究提供參考。

1 次生代謝產(chǎn)物的種類

銅綠假單胞菌的次生代謝產(chǎn)物有很多種，如：生長(zhǎng)素、鐵載體、抗生素、酶、糖類等。Bano等［2］研究表明，銅綠假單胞菌可產(chǎn)生IAA 和鐵載體。Ren等［3］進(jìn)一步證實(shí)了銅綠假單胞菌能夠產(chǎn)生鐵載體。Tambong等［4］、葛宜和等［5］及Wang等［6］研究表明，銅綠假單胞菌能夠產(chǎn)生吩嗪－1－羧酸或吩嗪－1－甲酰胺類抗生素。Gupta等［7］證實(shí)，銅綠假單胞菌能夠產(chǎn)生酶類化合物胞外幾丁質(zhì)酶，可用于除菌和防治癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。Lisa等［8］研究表明，銅綠假單胞菌可產(chǎn)生酸性磷酸酶，在醫(yī)學(xué)上用于診斷前列腺癌。Peng 等［9］和Sharon 等［10］研究表明，銅綠假單胞菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物中有脂肪酶，可催化一些酯類或不溶于水的物質(zhì)，常用于工業(yè)酶制劑。另外，銅綠假單胞菌還能產(chǎn)生其它多種類型的酶，如蛋白酶、脫氫酶等。Illakkiam 等［11］研究認(rèn)為，銅綠假單胞菌能夠產(chǎn)生抗真菌化合物3，4－dihydroxyn－methyl－4－（4－oxochroman－2－yl）丁酰胺。Hay 等［12］指出，銅綠假單胞菌能夠產(chǎn)生胞外多糖。Samadi等［13］和Al－Araji等［14］研究表明，銅綠假單胞菌能夠產(chǎn)生鼠李糖脂表面活性劑。由此可見，銅綠假單胞菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物種類繁多，這為解決我國(guó)植物病害防治、醫(yī)藥及衛(wèi)生中存在的生長(zhǎng)素少、催化劑缺乏等問題提供了材料來源。

2 次生代謝產(chǎn)物的提取方法

由于微生物產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物必須經(jīng)過提取、分離和純化才能獲得，其中，提取效率的高低對(duì)分離純化獲得純品具有十分重要的影響。目前，從微生物次生代謝產(chǎn)物中提取活性物質(zhì)的方法有很多種，如：溶劑法、滲漉法、蒸煮法、沉淀法、過濾法、離心法、電泳法等。不同的提取方法可得到不同的次生代謝產(chǎn)物。Qi等［15］采用氯仿從銅綠假單胞菌發(fā)酵液中提取獲得了次生代謝產(chǎn)物，并分析了其活性成分。Sharon等［10］通過硫酸銨沉淀和連續(xù)的羥基磷灰石柱層析獲得次生代謝產(chǎn)物。Jellouli等［16］采用丙酮沉淀、Sephadex G－75凝膠過濾盒超濾，然后使用10kPa的防滲膜，獲得了所需的次生代謝產(chǎn)物。Mountassif等［17］使用硫酸銨分餾和藍(lán)瓊脂糖凝膠電泳－色譜法提取次生代謝產(chǎn)物。Sharma等［18］將無菌體的培養(yǎng)液凍干，再用QSepharose柱層析，然后通過不同鹽梯度流量吸收次生代謝產(chǎn)物。

3 次生代謝產(chǎn)物的合成方法

由于微生物產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物的量較少，僅依靠微生物自然生長(zhǎng)很難滿足實(shí)際生產(chǎn)的需要。目前，常常采用改善發(fā)酵條件或工藝，達(dá)到提高發(fā)酵效率、獲取發(fā)酵產(chǎn)物的目的。研究表明，在最佳發(fā)酵條件的基礎(chǔ)上，通過合成方法可進(jìn)一步提高發(fā)酵效率。現(xiàn)在，微生物次生代謝產(chǎn)物的合成方法主要有2種，即生物合成法和化學(xué)合成法。生物合成法，就是通過改造目標(biāo)微生物的基因，調(diào)控次生代謝產(chǎn)物的量，從而達(dá)到提高效率的目的。目前主要采用生物合成法合成銅綠假單胞菌次生代謝產(chǎn)物。張圓等［19］研究認(rèn)為，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Pip 對(duì)銅綠假單胞菌吩嗪合成代謝具有促進(jìn)作用，提高了次生代謝產(chǎn)物的量。然而，國(guó)內(nèi)外對(duì)微生物次生代謝產(chǎn)物化學(xué)合成的研究成果相對(duì)較少，這可能跟微生物次生代謝產(chǎn)物的成分復(fù)雜有關(guān)，尤其是針對(duì)銅綠假單胞菌次生代謝產(chǎn)物的化學(xué)合成研究鮮見報(bào)道，有待進(jìn)一步研究。

4 次生代謝產(chǎn)物的作用機(jī)制

一般來講，微生物次生代謝產(chǎn)物的作用機(jī)制主要包括破壞酶活性、破壞細(xì)胞壁、損害DNA 活性、減少蛋白質(zhì)的量等方式。目前，在醫(yī)療、衛(wèi)生方面，銅綠假單胞菌次生代謝產(chǎn)物的作用機(jī)制十分復(fù)雜，主要有粘附素，如胞外粘膜；產(chǎn)生破壞細(xì)胞的胞外產(chǎn)物，如：熒光色素、蛋白酶、磷脂酶等；產(chǎn)生β－內(nèi)酰胺酶；產(chǎn)生耐藥質(zhì)粒，阻止藥物到達(dá)靶標(biāo)等。有時(shí)是幾種作用機(jī)制混雜在一起［20］。

在防治植物病害方面，國(guó)內(nèi)外有很多關(guān)于銅綠假單胞菌防治植物病原真菌病害和細(xì)菌病害的報(bào)道，但有關(guān)其次生代謝產(chǎn)物作用機(jī)制的研究報(bào)道較少，有待進(jìn)一步研究，為開發(fā)安全、環(huán)保、高效的生物農(nóng)藥提供理論依據(jù)。

5 次生代謝產(chǎn)物的用途

銅綠假單胞菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物種類多樣，其用途也十分廣泛。任小平等［21］報(bào)道銅綠假單胞菌粗提液對(duì)水稻紋枯病菌具有一定的抑制作用。Viji等［22］通過盆栽和大田試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，預(yù)先施用銅綠假單胞菌能很好地防治黑麥草灰斑病。Dutta等［23］研究發(fā)現(xiàn)，銅綠假單胞菌能誘導(dǎo)大豆系統(tǒng)抗病性，預(yù)防鐮刀菌的侵染。余超等［24］從香蕉植株體內(nèi)分離的銅綠假單胞菌內(nèi)生生防菌FJAT－346－PA 可對(duì)香蕉枯萎病具有較好的防治效果，盆栽防效和田間防效分別為83.67% 和82.00%。石晶盈等［25］從番木瓜果皮中分離篩選到一株具有拮抗活性的銅綠假單胞菌MGP3，對(duì)番木瓜炭疽病和疫霉病的防治效果分別達(dá)到50%和71%。郝曉娟等［26］研究發(fā)現(xiàn)，銅綠假單胞菌FJAT－346對(duì)香蕉、番茄、西瓜、甜瓜枯萎病菌、番茄灰霉病菌、油菜菌核病菌等均有良好的離體拮抗效果。銅綠假單胞菌次生代謝產(chǎn)物幾丁質(zhì)酶可以用于防治油菜菌核病［7］。吩嗪－1－羧酸（phenazine－1－carboxylic acid，PCA）和藤黃綠膿菌素（pyoluteorin，Plt）對(duì)多種農(nóng)作物病害的病原真菌、細(xì)菌具有顯著的抑制或殺滅作用［27］。突變酰胺酶由于含有酰胺酶蛋白，可用于單克隆抗體特異性檢測(cè)和一些致病細(xì)菌菌株的臨床判斷［28］。角蛋白酶具有降解作用，能夠降解一些比較頑強(qiáng)的蛋白質(zhì)，在化妝品和皮革制造業(yè)中都發(fā)揮著很大的作用［18］。Johnson等［29］證實(shí)羧酸酯酶在農(nóng)藥解毒方面有一定的作用。利用有機(jī)溶劑提取的蛋白質(zhì)還可以用作生物催化劑［30］。Isono等［31］證實(shí)三酰基甘油酰基水解酶能夠催化在油－水界面長(zhǎng)鏈甘油三酯的水解。Pabai等［32］證實(shí)三酰基甘油酰基水解酶能夠參與酯化和酯交換反應(yīng)，可用于食品添加劑、洗滌劑、臨床試劑、油脂化學(xué)品和清潔產(chǎn)業(yè)［8］。表面活性劑鼠李糖脂還可用于石油和制藥行業(yè)［13］。

6 問題與展望

銅綠假單胞菌次生代謝產(chǎn)物在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥和化妝品行業(yè)都有十分廣闊的應(yīng)用前景，但是，對(duì)其次生代謝產(chǎn)物的研究不深入，也不徹底，仍存在不少問題。

（1）成分解析困難。由于銅綠假單胞菌的次生代謝產(chǎn)物種類較多，依靠現(xiàn)有的技術(shù)水平，還不能把所有的代謝產(chǎn)物全部分析出來，今后還需明確其成分和結(jié)構(gòu)。況且，利用現(xiàn)在的分離純化技術(shù)獲得較純的次生代謝產(chǎn)物還很困難，盡管已有研究結(jié)果顯示，采用HSCCC技術(shù)可以提高分離效率和純度，但還有待驗(yàn)證。

（2）代謝物產(chǎn)量低。僅依靠發(fā)酵提高次生代謝產(chǎn)物的量十分有限，為獲得大量的次生代謝產(chǎn)物，選擇最佳提取方法十分重要，但這不僅涉及發(fā)酵條件，還涉及到提取方法的不同，由于被提取的次生代謝產(chǎn)物的性質(zhì)不同，獲取次生代謝產(chǎn)物就需要考慮多種因素，既要保證獲取最多的次生代謝產(chǎn)物，又要使其不失活。而最新采用生物合成提高次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，也有待在生產(chǎn)中進(jìn)一步驗(yàn)證；另外，采用化學(xué)合成方法合成次生代謝產(chǎn)物的難度較大，不僅需要投入大量的人力、物力和財(cái)力，而且還要耗費(fèi)時(shí)間和精力。

（3）污染環(huán)境。目前多采用有機(jī)溶劑提取次生代謝產(chǎn)物，但是有機(jī)溶劑不僅污染環(huán)境，而且造成不少浪費(fèi)。最新的研究結(jié)果表明，采用超臨界萃取技術(shù)，可以解決有機(jī)溶劑污染和浪費(fèi)問題，提高提取效率，有望在今后推廣和應(yīng)用。

（4）商品研發(fā)困難。以銅綠假單胞菌次生代謝產(chǎn)物為先導(dǎo)化合物開發(fā)的產(chǎn)品還比較少，而且防治效果不穩(wěn)定，需要通過結(jié)構(gòu)改造或化學(xué)修飾克服弊端，增強(qiáng)其穩(wěn)定性。

隨著人們生活水平的提高和安全意識(shí)的增強(qiáng)，化學(xué)農(nóng)藥的應(yīng)用越來越受到限制，甚至停用，因此，探索能替代化學(xué)農(nóng)藥的新藥劑迫在眉睫。近年來，從拮抗微生物次生代謝物中篩選生物活性物質(zhì)成為研究熱點(diǎn)，研究者相繼明確了活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，研發(fā)出具有推廣價(jià)值的生物農(nóng)藥。由于此類型農(nóng)藥具有高效、低毒、安全、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)勢(shì)，將來替代化學(xué)農(nóng)藥成為一種必然趨勢(shì)。銅綠假單胞菌作為一種具有抑菌活性的微生物，可產(chǎn)生多種抑菌活性物質(zhì)，如：綠膿菌素、吩嗪－1－羧酸、吩嗪－1－甲酰胺等，但這些天然化合物多數(shù)不易溶于水，在應(yīng)用時(shí)需要添加有機(jī)溶劑，給環(huán)境帶來了二次污染，增加了推廣和應(yīng)用的難度。自利用生物農(nóng)藥防治植物病害以來，研究者一直致力于降低環(huán)境污染，提高防治效果，尤其是減輕二次污染，因此，如何通過結(jié)構(gòu)改造或添加水溶性助劑提高天然活性物質(zhì)的水溶性，將是未來生防專家研究的重要課題，也是將來研究的重要方向。

總之，由于銅綠假單胞菌的次生代謝產(chǎn)物種類多，應(yīng)用范圍廣，對(duì)于存在的問題還需要在科學(xué)實(shí)踐中不斷探索，以盡早滿足科學(xué)要求和社會(huì)需要。

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