胃袖狀切除附加空回腸吻合術(shù)對ZDF大鼠GLP-1蛋白表達的影響

周小鋼，王愷京，徐安安，高 瑋，陸佳軍，朱江帆

(同濟大學(xué)附屬東方醫(yī)院，上海，200120)

近年，減重手術(shù)作為治療2 型糖尿病及相關(guān)代謝性疾病的重要手段，其作用效果已得到了眾多臨床資料與實驗數(shù)據(jù)的證實［1-2］。術(shù)式主要有胃袖狀切除(sleeve gastrectomy，SG)、胃旁路術(shù)及胃袖狀切除附加轉(zhuǎn)流術(shù)等。研究表明，胰高血糖素樣肽-1(glucagonlike peptide 1，GLP-1)分泌水平變化可能是減重手術(shù)治療2 型糖尿病的主要機理［3］。GLP-1 主要是由末端回腸L 細胞分泌，GLP-1 分泌的增強主要由于食物較早地刺激末端回腸L 細胞引起，可有效降低血糖［4-6］。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)SG 組與胃袖狀切除附加空回腸吻合(sleeve gastrectomy plus side-to-side jejunoileal anastomosis，JI-SG)組術(shù)后血清GLP-1 水平明顯升高［7］，然而L 細胞組織學(xué)是否發(fā)生了改變，對此我們不得而知?；诖?，我們在SG 的基礎(chǔ)上附加空回腸吻合術(shù)，從而使得食物提早刺激末端回腸，觀察末端回腸黏膜組織L 細胞組織學(xué)改變及相應(yīng)血液激素水平的改變，從而探討GLP-1 分泌水平改變的原因，并進一步檢驗GLP-1 在減重手術(shù)中的作用，進而優(yōu)化減重手術(shù)方式。

1 資料與方法

1.1 實驗動物準(zhǔn)備與分組 雄性10 周齡糖尿病肥胖(Zucker diabetic fatty，ZDF)大鼠30 只(購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司)，飼養(yǎng)于同濟大學(xué)動物實驗中心無特定病原體(specific pathogen free，SPF)環(huán)境中，將大鼠按隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)(sham surgery，SS)組、SG 組與JI-SG組。JI-SG 組行胃袖狀切除附加空回腸側(cè)側(cè)吻合術(shù)，SG 組行袖狀胃切除術(shù)，SS 組行假手術(shù)。

1.2 實驗動物手術(shù)干預(yù) SG 組手術(shù)方法［8］:沿胃部大彎側(cè)縱行切除整個胃底及約3/4 胃體，縫合胃切緣止血后將胃置于原位;JI-SG 組手術(shù)方法:上述胃袖狀切除后距Treitz 韌帶及回盲瓣各20 cm 游離出空腸、回腸并行側(cè)側(cè)吻合術(shù);SS 組手術(shù)方法:大鼠開腹后即關(guān)閉。各實驗組關(guān)腹前均腹腔注射1 ml 慶大霉素，三組實驗時間大致相等，以消除手術(shù)應(yīng)激對結(jié)果的影響。

1.3 標(biāo)本的制備 血清學(xué)標(biāo)本:術(shù)前2 d 及術(shù)后規(guī)律兩周一次取眶靜脈血約0.5 ml，離心后取上清液置于-20 攝氏度冰箱保存;組織學(xué)標(biāo)本:于術(shù)后第12 周處死大鼠，并取距回盲瓣5 cm 末端回腸組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，切片機制備石蠟切片。

1.4 檢測項目及方法

1.4.1 血糖 術(shù)前2 d 及術(shù)后兩周一次眶靜脈采血，使用羅氏血糖儀檢測其血糖水平。

1.4.2 末端回腸黏膜GLP-1 水平測定 采用免疫組化SP法，常規(guī)脫蠟水化后抗原修復(fù);放入3%過氧化氫溶液，孵育25 min;滴加Ⅰ抗(購自美國Abcam 公司)，稀釋比例為1∶100;滴加Ⅱ抗，室溫孵育50 min;DAB 顯色，陽性為棕黃色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。顯微鏡下玻片組織充滿視野拍照，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0 軟件選取相同的棕黃色作為判斷所有照片陽性的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，對每張照片進行分析得出每張照片陽性的累積光密度值(integral optical density，IOD)，保存圖片中組織的面積(AREA)，IOD/AREA 計算出平均光密度值(Mean Density)。

1.4.3 血清胰島素、GLP-1 水平測定 采用ELISA 法檢測大鼠血清胰島素及GLP-1 水平，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書(購自美國R＆D 公司)進行。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，量化數(shù)據(jù)用(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，所獲數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩顯著性檢測采用LSD-t 檢驗;P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 存活率 SS 組大鼠均存活，存活率100%;SG組大鼠死亡1 只，術(shù)后第2 天吻合口漏腹腔感染死亡，存活率為90%;JI-SG 組死亡3 只，其中2 只術(shù)后第10 天吻合口粘連狹窄引起梗阻而死亡，另1 只于術(shù)后第20 天極度消瘦死亡。3 組總的存活率為86.7%。

2.2 回腸末端黏膜組織學(xué)檢測 GLP-1 的產(chǎn)生部位主要位于大鼠回腸末端黏膜組織L 細胞，細胞數(shù)量較多，胞質(zhì)深染。陽性強度分為4 級:染色無色計為0，淡黃色為1，棕黃色2，棕褐色為3。平均光密度值評估GLP-1 在回腸末端黏膜組織表達水平，SS組、SG 組及JI-SG 組分別為:0.008492 ±0.0019246，0.009091 ±0.0021523，0.011408 ±0.0027251。JISG 組平均光密度明顯高于SS 組及SG 組(P ＜0.05)，局部可見L 細胞增生。SG 組平均光密度值高于SS 組。見圖1、圖2、表1。

2.3 血清GLP-1 水平改變 術(shù)前各組血清GLP-1水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)，術(shù)后SS 組與術(shù)前水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)。SG 組術(shù)后GLP-1 水 平 緩 慢 上 升，至 12 周 達(1. 79 ±0.12)pmol/L，高于SS 組(P ＜0.05)。術(shù)后2 周JISG 組由術(shù)前(1.69 ±0.1)pmol/L 上升至(1.92 ±0.12)pmol/L，隨后緩慢上升，至12 周達(1.97 ±0.11)pmol/L，術(shù)后各時間點與術(shù)前相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)，術(shù)后同時間點與其他兩組的差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。見表2。

2.4 血糖水平改變 術(shù)前各組血糖水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)，術(shù)后2 周SG 及JI-SG 組血糖即有明顯下降，術(shù)后2 周SG 組血糖水平由術(shù)前(11.4 ±3.1)mmol/L 降至(6.9 ±1.6)mmol/L，隨后逐漸恢復(fù)上升，并超過術(shù)前水平，至12 周升至(13.4 ±2.8)mmol/L，但同時間點低于SS 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。術(shù)后2 周JI-SG 組血糖水平由 術(shù)前(12. 4 ± 1. 5)mmol/L 降至(6. 3 ±0.7)mmol/L，隨后長時間保持穩(wěn)定水平，至12 周達到(5.1 ±0.9)mmol/L，同時間點明顯低于SS 組及SG 組(P ＜0.05)。見表3。

2.5 血清胰島素水平的改變 術(shù)前各組胰島素水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)，SS 組胰島素水平呈現(xiàn)緩慢上升，至12 周達(7.51 ±1.6)mU/L。術(shù)后2 周，SG 組、JI-SG 組 分 別 由 術(shù) 前(5. 13 ±1.2)mU/L、(5. 24 ± 1. 1)mU/L 升 至(6. 53 ±1.4)mU/L、(6.57 ±1.3)mU/L ，呈現(xiàn)與SS 組相同趨勢。隨后緩慢下降，術(shù)后12 周SG 組達到(5.21±1.4)mU/L水平，與術(shù)前相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05);JI-SG 組達到(4.53 ±1.3)mU/L，明顯低于術(shù)前及其他兩組水平(P ＜0.05)。見表4。

圖1 各組末端回腸粘膜組織GLP-1 蛋白表達(1-HE ×200;2-HE ×400)a:SS 組GLP-1 蛋白，胞質(zhì)淡染;b:SG 組GLP-1 蛋白，胞質(zhì)染色偏黃色;JI-SG 組GLP-1 蛋白，胞質(zhì)深染，為棕黃色，細胞數(shù)量明顯增加。

圖2 各組GLP-1 在末端回腸黏膜組織表達比較

表1 末端回腸黏膜組織GLP-1 表達光密度值的比較(±s)

表1 末端回腸黏膜組織GLP-1 表達光密度值的比較(±s)

* P ＜0.05 vs.SS 組，ΔP ＜0.05 vs.SG 組

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表2 各組手術(shù)前后血清GLP-1 水平的比較［(±s)，ρ/pmol·L-1］

表2 各組手術(shù)前后血清GLP-1 水平的比較［(±s)，ρ/pmol·L-1］

* P ＜005 vs.術(shù)前;ΔP ＜0.05 vs.SS 組;#P ＜0.05 vs.SG 組

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表3 各組手術(shù)前后血糖水平的比較［(±s)，ρ/pmol·L-1］

表3 各組手術(shù)前后血糖水平的比較［(±s)，ρ/pmol·L-1］

* P ＜005 vs.術(shù)前;ΔP ＜0.05 vs.SS 組;#P ＜0.05 vs.SG 組

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表4 各組手術(shù)前后胰島素水平的比較［(±s)，ρ/mU·L-1］

表4 各組手術(shù)前后胰島素水平的比較［(±s)，ρ/mU·L-1］

* P ＜005 vs.術(shù)前;ΔP ＜0.05 vs.SS 組;#P ＜0.05 vs.SG 組

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3 討 論

SG 是近年備受關(guān)注的減重術(shù)式之一，具有手術(shù)操作簡單、安全、有效、并發(fā)癥發(fā)生率低等優(yōu)點［9-12］，然而一些資料也表明了SG 療效不如轉(zhuǎn)流術(shù)、長期療效不明確、術(shù)后容易反彈等缺點［13-14］。Melissas等［15］將JI-SG 與單純SG 進行了對比分析，發(fā)現(xiàn)JISG 在改善2 型糖尿病方面明顯優(yōu)于SG;同時也發(fā)現(xiàn)JI-SG 術(shù)后食物自十二指腸到達盲腸時間為11 min，而SG 術(shù)后需要31 min;JI-SG 術(shù)后未出現(xiàn)死亡或重大手術(shù)并發(fā)癥。JI-SG 操作簡單、不改變腸道結(jié)構(gòu)的連續(xù)性，因此認為JI-SG 是簡單、安全、有效的減重術(shù)式;同時空回腸吻合術(shù)可在單純SG 失敗或術(shù)后出現(xiàn)反彈的情況下再行實施。本實驗采用ZDF 大鼠制作JI-SG 模型，觀察術(shù)后降糖作用及相應(yīng)激素水平的改變，以探討可能機制。

通過觀察比較我們發(fā)現(xiàn)，JI-SG 組GLP-1 水平的血清學(xué)檢測水平明顯高于SG 組與SS 組，組織學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)JI-SG 組蛋白表達水平顯著增加，染色為棕黃色，同時伴有L 細胞的增生。在血糖控制、胰島素水平方面，JI-SG 均體現(xiàn)出優(yōu)勢，JI-SG 術(shù)后血糖保持穩(wěn)定的低水平，而SG 組血糖在術(shù)后第二周達到最低值后緩慢回升，表明SG 具有降糖的療效，同時也存在血糖反彈的現(xiàn)象，這與Himpens 等［16］的研究結(jié)果一致。然而是什么原因?qū)е铝薐I-SG 在治療2型糖尿病方面的顯著療效?食物較早刺激末端回腸可顯著增強GLP-1 的分泌，而GLP-1 水平升高是導(dǎo)致血糖下降的關(guān)鍵因素。GLP-1 主要由末端回腸L細胞分泌產(chǎn)生，GLP-1 可促進糖原合成、增加胰島素基因表達、胰島素的分泌、抑制胰高血糖素分泌、促進β 細胞增生并抑制其凋亡［17-20］;目前GLP-1 降糖療效已得到證實，相關(guān)藥物已應(yīng)用于臨床［21］。本實驗中血清GLP-1 水平在第2 周即有明顯上升，之后保持穩(wěn)定水平，第12 周組織學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)L 細胞分泌GLP-1 功能增強同時伴有顯著增生，我們認為L 細胞在發(fā)生組織學(xué)改變前即有分泌功能增強現(xiàn)象，長期的代償作用導(dǎo)致細胞的增生，這種組織學(xué)改變可能是機體長期維持GLP-1 高水平的重要原因。

SG 組大鼠的胃腸道生理結(jié)構(gòu)并未改變，但其組血漿GLP-1 水平及蛋白表達水平均有提高，現(xiàn)有資料表明［22-24］，SG 手術(shù)切除胃底、大部分胃體，導(dǎo)致體內(nèi)Ghrelin 激素水平降低，而Ghrelin 可抑制胰島素的分泌及外周組織利用葡萄糖，同時Ghrelin 可促進胃排空，使得食物較早刺激回腸產(chǎn)生較多GLP-1，因此Ghrelin 激素水平的降低可能是SG 對2 型糖尿病有治療效果的原因之一。朱江帆等［25］則提出“胃中心學(xué)說”，認為減重手術(shù)關(guān)鍵環(huán)節(jié)在胃大彎，現(xiàn)有主流減重手術(shù)均減少了食物對胃的刺激。很有可能導(dǎo)致某種特殊因子分泌減少，從而緩解胰島素抵抗，交感神經(jīng)張力降低，導(dǎo)致糖尿病、高血壓、多囊卵巢綜合征等代謝性疾病得到緩解，因此更多的胃腸道未知激素尚待研究。

本實驗證實了JI-SG 治療ZDF 大鼠2 型糖尿病的持續(xù)有效性，其主要作用機制可能與末端回腸L細胞增生及其分泌GLP-1 增強有關(guān)。JI-SG 使部分未消化食糜較早進入末端回腸，起到吸收不良的作用，同時未完全消化食糜較早刺激末端回腸L 細胞，促進其分泌GLP-1 激素。空回腸側(cè)側(cè)吻合術(shù)使包括曠置腸段在內(nèi)的腸攀均有食物通過，可避免因腸襻曠置導(dǎo)致的菌群改變、膽汁酸代謝改變、曠置腸襻細胞萎縮等問題?！氨M量減少胃腸道結(jié)構(gòu)破壞同時獲得最佳減重及改善代謝效果”是減重手術(shù)改進的努力方向，此術(shù)式為術(shù)式改進提供了一個方案，其療效尚待臨床長期的隨訪研究。

［1］Pories WJ.Diabetes:the evolution of a new paradigm［J］.Ann Surg，2004，239(1):12-13.

［2］Kopelman PG.Obesity as a medical problem［J］.Nature，2000，404(6778):635-643.

［3］Tammy L，Kindel Stephanie M，Yoder Randy J，et al.Duodenal-jejunal exclusion improves glucose tolerance in the diabetic，Goto-Kakizaki rat by a GLP-1 receptor-mediated mechanism［J］.J Gastrointest Surg，2009，13(10):1762-1772.

［4］Wang TT，Hu SY，Gao HD，et al.Ileal transposition controls diabetes as well as modified duodenal jejunal bypass with better lipid lowering in a nonobese rat model of type II diabetes by increasing GLP-1［J］.Ann Surg，2008，247(6):968-975.

［5］Patriti A，F(xiàn)acchiano E，Annetti C，et al.Early improvement of glucose tolerance after ileal transposition in a non-obese type 2 diabetes rat model［J］.Obes Surg，2005，15(9):1258-1264.

［6］De Paula AL，Stival AR，Macedo A，et al.Prospective randomized controlled trial comparing 2 versions of laparoscopic ileal interposition associated with sleeve gastrectomy for patients with type 2 diabetes with BMI 21-34 kg/m2［J］. Surg Obes Relat Dis，2010，6(3):296-304.

［7］王愷京，徐安安，周小鋼，等.袖狀胃切除術(shù)附加空回腸側(cè)側(cè)吻合術(shù)減重與代謝改善作用［J］.中華消化外科雜志，已接受.

［8］王愷京，徐安安，周小鋼，等.ZDF 大鼠胃袖狀切除附加空回腸側(cè)側(cè)吻合術(shù)動物模型的建立［J］.腹腔鏡外科雜志，2015，20(1):1-4.

［9］Melissas J，Koukouraki S，Askoxylakis J，et al.Sleeve gastrectomy-a restrictive procedure?［J］.Obes Surg，2007，17(1):57-62.

［10］Aggarwal S，Kini SU，Herron DM.Laparoscopic sleeve gastrectomy for morbid obesity:a review［J］.Surg Obes Relat Dis，2007，3(2):189-194.

［11］Cottam D，Qureshi FG，Mattar SG，et al.Laparoscopic sleeve gastrectomy as an initial weight-loss procedure for high—risk patients with morbid obesity［J］.Surg Endosc，2006，20(6):859-863.

［12］Kodama Y，Zhao CM，Kulseng B，et al.Eating behavior in rats subjected to vagotomy，sleeve gastrectomy，and duodenal switch［J］.Gastrointest Surg，2010，14(10):1502-1510.

［13］Rice RD，Simon TE，Seery JM，et al. Laparoscopic sleeve gastrectomy:outcomes at a military training center［J］. Am Surg，2010，76(8):835-840.

［14］Langer FB，Bohdjalian A，Shakeri-Leidenmiihler S，et al.Conversion from sleeve gastrectomy to Roux-en-Y gastric bypass-indications and outcome［J］.Obes Surg，2010，20(7):835-840.

［15］Melissas J，Peppe A，Askoxilakis J，et al.Sleeve gastrectomy plus side-to-side jejunoileal anastomosis for the treatment of morbid obesity and metabolic diseases:a promising operation［J］.Obes Surg，2012，22(7):1104-1109.

［16］Himpens J，Dobbeleir J，Peeters G. Long-term results of laparoscopic sleeve gastrectomy for obesity［J］. Ann Surg，2010，252(2):319-324.

［17］Mingrone G，Castagneto-Gissey L.Mechanisms of early improvement/resolution of type 2 diabetes after bariatric surgery［J］.Diabetes Metab，2009，35(6):518-523.

［18］Buchwald H，Avidor Y，Braunwald E，et al. Bariatric surgery:a systematic review and meta-analysis［J］. JAMA，2004，292(14):1724-1737.

［19］MaeDonald PE，EI-Koly W，Riedel MJ，et al.The multiple actions of GLP-1 on the process of glucose-stimulated insulin secretion［J］.Diabetes，2002，51 Suppl 3:S434-S442.

［20］de Gordejuela AG，Pujol Gebelli J，García NV，et al.Is sleeve gastrectomy as effective as gastric bypass for remission of type 2 diabetes in morbidly obese patients?［J］.Surg Obes Relat Dis，2011，7(4):506-509.

［21］J?rgensen NB，Dirksen C，Bojsen-M?ller KN，et al.Exaggerated glucagon-like peptide 1 response is important for improved βcell function and glucose tolerance after Roux-en-Y gastric bypass in patients with type 2 diabetes［J］.Diabetes，2013，62(9):3044-3052.

［22］Tharakan G，Tan T，Bloom S. Emerging therapies in the treatment of‘diabesity’:beyond GLP-1［J］. Trents Phamacol Sci，2011，32(1):8-15.

［23］Murata M，Okimura Y，lida K，et al.Ghrelin modulates the downstream molecules of insulin signaling in hepatoma cells［J］.J Biol Chem，2002，277(7):5667-5674.

［24］Broglio F，Gottero C，Benso A，et al.Effects of ghrelin on the insulin and glycemic responses to glucose，arginine，or free fatty acids load in humans［J］.J Clin Endocrinol Metab，2003，88(9):4268-4272.

［25］朱江帆，周小鋼.腹腔鏡胃袖狀切除術(shù)臨床應(yīng)用價值［J］.中國實用外科雜志，2014，34(11):1032-1035.