文山石漠化地區豆科植物根瘤菌的6S rDNA序列分析

張敬宜　王金華　熊智　思斯　王凱　楊應勇

摘要：為研究和利用云南省文山石漠化地區豆科植物根瘤菌的種質資源多樣性，對從文山地區豆科植物根瘤分離獲得的3株根瘤菌株進行6S rDNA全序列分析，并與相關參比菌株的6S rDNA序列進行比較及聚類分析，建立3株文山石漠化地區豆科植物根瘤菌的發育樹狀圖，初步確定3株豆科植物根瘤菌的分類地位，為以后石漠化生態修復中種植豆科植物接種適宜的根瘤菌提供種質資源。

關鍵詞：石漠化；豆科植物；根瘤菌；6S rDNA；系統發育分析

中圖分類號： S82；S56文獻標志碼： A

文章編號：002-302（204）2-0044-03

石漠化是指在喀斯特脆弱的巖溶生態環境下，由于人類不合理的社會經濟活動而造成的地表植被破壞、水土嚴重流失、土壤貧瘠、基巖裸露或礫石堆積等生態系統退化現象，是巖溶地區土壤退化的極端形式。石漠化地區干旱，土壤肥力下降，土地生產力衰減，嚴重影響了農、林、牧業的生產，當地群眾的生活和生產環境日趨惡化。云南省是我國石漠化主要分布區之一，石漠化土地總面積28820萬hm2，占云南省國土總面積的535%。在個石漠化分布州（市）中，文山州居首位，石漠化總面積838萬hm2，主要分布在廣南、丘北和文山等縣，是典型的峰叢洼地石漠化類型[2]。

根瘤菌是一類存在于土壤中的革蘭氏陰性細菌，它能夠侵染豆科植物的根部或莖部形成共生體——根瘤（或莖瘤），并在其中將空氣中的游離態的氮氣轉化成植物可以利用的化合態氮，為宿主植物的生長提供必需的氮素營養。根瘤菌-豆科植物共生固氮體系是已知固氮能力最強的生物固氮體系之一，能有效促進植物生長，增加土壤肥力[3]。因此，發現新的根瘤菌資源，建立高效的共生體系是石漠化地區植被恢復的首要工作。

目前許多學者對國內很多地區的豆科植物根瘤菌進行了研究[4-8]，但對文山石漠化地區豆科植物根瘤菌的研究還鮮見報道。本試驗以文山石漠化地區的豆科植物為材料，調查這一特殊生境下的根瘤菌資源，研究其遺傳多樣性，篩選優良根瘤菌，在石漠化生態恢復時，拌種于豆科植物的種子，與豆科植物形成共生固氮體系，為改良石漠化土壤、恢復石漠化生態環境提供優質種庫和有效途徑。

材料與方法

根瘤的采集

20年4月在云南省文山州廣南縣、文山市、丘北縣、硯山縣4個地區采集豆科植物，挖出根須，挑選新鮮、個大、飽滿的根瘤裝入裝有干燥變色硅膠的離心管，密封。供試菌株編號、宿主植物名稱及來源見表。

2根瘤菌的分離及篩選

根瘤帶回實驗室后，用無菌水洗滌，以 75%乙醇3～5 min、0% HgCl2 ～3 min進行表面滅菌，無菌水沖洗5～6次，然后在無菌條件下用滅菌的手術刀將根瘤切開，并用滅菌的鑷子擠出汁液，最后接種于YMA培養基上，于28 ℃下進行培養。采用稀釋平板劃線法，分離純化，挑取單菌落，革蘭氏染色，鏡檢，最后接入試管斜面中保藏備用。

3DNA的提取

將活化的菌株接種于TY液體培養基中，在28 ℃條件下、40 r/min振蕩培養至對數生長期，收集菌體，用細菌DNA試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取DNA。

46S rDNA CR擴增及測序

（）引物選擇。正向引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3′；反向引物：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3′[9]，均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。（2）反應體系。0 μmol/L正向引物和反向引物各 μL，2×Taq CR MasterMix 25 μL，25 ng/L模板DNA 25 μL，加ddH2O至50 μL。（3）反應程序。95 ℃預變性5 min；95 ℃變性 min，56 ℃退火 min，72 ℃延伸3 min，30 個循環；72 ℃終延伸5 min，-20 ℃保存。（4）CR產物檢測。CR擴增產物用%瓊脂糖凝膠電泳檢測。然后將CR反應產物經純化后直接測序，測序工作在上海英濰捷基公司完成。

5多序列比較及進化樹的建立

將測序結果通過美國國立生物信息中心和歐洲生物信息所的國際網站進行BLAST分析，進一步驗證測序結果，并進行多序列比較，建立系統進化樹。

2結果與分析

26S rDNA CR擴增

圖顯示，通用引物對根瘤菌的DNA進行6S rDNA擴增后，均有 500 bp左右的擴增條帶。

[FK（W9][TZYtif][FK）]

22序列測定結果

將菌株的6S rDNA序列與GenBank數據庫中的序列進行同源性比對，運用軟件MEGA 40按bootstrap的UGMA法構建系統發育樹（表、表2、圖2）。

從系統發育樹狀圖上看，這3株菌屬于不同的歸屬，說明文山石漠化地區豆科植物根瘤菌多樣性很豐富。有7株菌屬于Rhizobium sp系統發育分支，但它們分為兩大分支，SWFU-W0、SWFU-W02、SWFU-W03、SWFU-W0為一個分支，SWFU-W58、SWFU-W63、SWFU-W64為另一分支的根瘤菌屬（Rhizobium sp），其中來自不同采樣地相同寄主（三葉草）的代表菌株SWFU-W0、SWFU-W02、SWFU-W03，說明在不同的生境中Rhizobium sp可以與寄主形成共生關系。SWFU-W3、SWFU-W4、SWFU-W50屬于熱帶根瘤菌屬（Rhizobium tropici），它們的寄主植物均為木本豆科植物木藍，但是木藍分別采集于文山市、廣南縣和硯山縣3個地區。SWFU-W90、SWFU-W98、SWFU-W99與根癌土壤桿菌（Agrobacterium tumefaciens）的同源性最接近，它們與其他菌株的相似性也較小（表2），故它們屬于根癌土壤桿菌。[FL）]

[FK（W5][HT6H][Z]表文山石漠化地區自然生長的豆科植物根瘤菌[HTSS][STBZ]

[H5][BG（！][BHDFG2，WK6，WK5，WK8，WK5，WK8。2W]序號菌株號寄主植物中文名植物學名采集地點生境

3討論

目前石漠化已經成為導致西南巖溶地區生態惡化的主要因素，而人為破壞造成的地表植被覆蓋率下降是石漠化的根本原因，因此恢復植被是石漠化治理的首要任務。有機質、N、、K、Ca、Mg等養分有效含量低是石漠化植被恢復的最主要障礙[0-]。國內外許多學者的研究發現，通過構建根瘤菌-宿主植物共生體系，不僅能夠顯著促進植物生長，同時還[FL）]

[FK（W2][TZY2tif][FK）]

[FL（2K2]能夠增加土壤肥力，改良土壤結構。如李建華等在山西礦區復墾土壤上種植接種根瘤菌的白三葉草（Trifolium[KG3]repens），結果表明接種根瘤菌能顯著提高植物生物量和土壤養分利用率[2]；Requena等用根瘤菌接種絨毛花（Anthyllis cytisoides）幼苗，對西班牙南部一個半干旱沙漠地區的退化植被進行恢復，發現接種根瘤菌在提高植株在半干旱沙漠地區的定殖和存活能力、增加土壤的質量和肥力、促進自然群落演替過程中氮的轉移等方面效果最好[3]。根瘤菌與豆科植物的共生關系會因生態環境的差異而具多樣性[4-5]，因此，在應用豆科植物-根瘤菌共生體系來修復石漠化退化地土壤和生態時，應根據石漠生態環境及宿主植物兩方面因素選擇合適的根瘤菌，為豆科植物選擇最佳匹配的根瘤菌。本研究對文山石漠化地區豆科植物根瘤菌的分離鑒定，對建立石漠地區的根瘤菌菌庫和改善石漠化環境具有重要的意義。

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