保護劑在微生物真空冷凍干燥中的應用

牛曉影,鄧麗莉,曾凱芳,2,*

(1.西南大學食品科學學院,重慶 400715;2.農業部農產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(重慶),重慶 400715)

保護劑在微生物真空冷凍干燥中的應用

牛曉影1,鄧麗莉1,曾凱芳1,2,*

(1.西南大學食品科學學院,重慶 400715;2.農業部農產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(重慶),重慶 400715)

真空冷凍干燥后微生物較低的存活率在一定程度上限制了諸如采后果蔬生防試劑、益生菌、發酵劑等的開發及應用,而保護劑的加入可以較大幅度的彌補這一劣勢。本文綜述了保護劑在微生物真空冷凍干燥中的應用狀況,將目前使用的保護劑按照化學結構、來源、穿透能力、保護階段等不同方法進行了分類;對常用的幾種保護劑脫脂奶粉、海藻糖以及谷氨酸鈉的保護機理及應用進行了介紹;并闡述了保護劑的增效途徑,微生物冷凍干燥使用單一保護劑不足以得到理想的存活率,只有在合適的條件下對保護劑進行復配增效才能夠使生防試劑、發酵劑等的商業化應用成為可能。

真空冷凍干燥,保護劑,保護機理,增效途徑

在食品領域,微生物真空冷凍干燥技術主要應用在采后果蔬生防試劑、益生菌、發酵劑等的研究上,與其他保種技術相比,真空冷凍干燥技術可使菌懸液形成干粉方便運輸、銷售及使用[1],且形成干粉后微生物的生化反應降到最低可使貯藏期內干粉的生物、化學、物理性能保持相對穩定[2],再者凍干粉使用真空包裝技術可使微生物免受貯藏過程中的污染[3]。然而真空冷凍干燥的微生物在經歷了冷凍、干燥、貯藏三個階段后,它的存活率受到嚴重影響,這也是目前限制真空冷凍干燥微生物商業化應用最重要的原因。

事實上,影響微生物真空冷凍干燥后存活率的原因主要有兩方面,一方面是微生物自身,另一方面是冷凍、干燥、貯藏微生物的環境條件。其中對微生物自身來說,它的培養條件、微生物收獲期、冷凍干燥前微生物的濃度均會影響凍干后微生物的存活率[4-6]。另一方面有研究表明,真空冷凍干燥后微生物存活率下降的最主要原因是冷凍干燥過程中冰晶的形成、高濃度胞內溶質引起的高滲透壓導致微生物細胞膜破壞,此外脫水影響了親水性大分子性能,蛋白質降解等最終影響了微生物的存活率[7]。

針對冷凍、干燥、貯藏等外部環境對微生物存活率造成的影響,可在菌懸液中加入合適的保護劑,減少或避免外部惡劣環境條件對微生物造成破壞,進而提高微生物的存活率,為其商業化應用提供可能。

1 保護劑的幾種分類方法

1.1 按保護劑的化學結構進行分類

按保護劑的化學結構大體可將保護劑分為三類:糖類保護劑、蛋白類保護劑、其他。糖類和蛋白質是相關研究中應用最廣泛的兩類保護劑,是研究人員選擇保護劑首要考慮的對象[8]。

糖類保護劑主要包括單糖、二糖、三糖。單糖中最常用的保護劑有:葡萄糖、果糖、半乳糖。二糖中最常用的保護劑有:海藻糖、蔗糖、乳糖。三糖中最常用的保護劑是棉籽糖。有研究表明單糖中半乳糖保護效果最好,三糖中棉籽糖對細菌的保護作用較好[9-10],二糖的保護效果普遍較好[11-13],Costa等對成團泛菌(Pantoeaagglomerans)進行研究,得出最佳的保護劑是海藻糖和蔗糖,當使用5g/100mL的海藻糖時,其存活率達到83%左右,當使用10g/100mL的蔗糖時,存活率達到75%左右[14]。糖類保護性能的不同源于它們與水結合能力和抑制細胞內外冰晶形成的差異[15],與是否能夠參與代謝沒有多大關系[16]。有研究表明二糖比三糖應用廣泛是因為二糖比三糖對磷脂膜有更強的結合力[17]。

蛋白類保護劑主要包括牛乳蛋白、血清、大豆蛋白、膠原蛋白等,有研究表明蛋白質比糖類有更高的玻璃化轉變溫度,在冷凍干燥形成玻璃態方面,蛋白質比糖類扮演更重要的角色[1],此外蛋白質可在微生物細胞壁外形成保護性外膜[9]。0.1～4g/100mL的血清白蛋白很長時間被作為病毒和立克次體的凍干保護劑[18]。有研究表明,2g/100mL的類人膠原蛋白可使長雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)存活率達到39.09%±1.27%[19]。Wang等以發酵豆奶作為保護劑可使長雙歧桿菌(B.longumB6)的存活率達到43%～52%[20]。

1.2 按保護劑的來源進行分類

按保護劑的來源可將保護劑分為:內源性保護劑、外源性保護劑。前者是指微生物本身存在的或培養條件、周圍環境改變使其自身合成的具有保護性的物質,后者是指冷凍前另加入菌懸液中以保護為目的的物質。此種分類研究方法主要針對的是海藻糖。有研究表明在冷凍干燥過程中,只有細胞膜兩側都存在海藻糖才能有效的保護酵母菌[21],酵母菌有特殊的海藻糖載體[22],但是Zayed等的研究證明冷凍前的時間不足以使細胞運輸足夠的海藻糖進入細胞內以提高酵母菌的存活率[23]。

最早研究發現很多酵母菌細胞內都存在一定量的海藻糖,它可使酵母菌在很多惡劣的環境中生存,例如高溫、冷凍、干燥、高滲透壓等。為了提高細胞質中海藻糖的含量,可在培養微生物過程中,用海藻糖[24]或檸檬酸[25]取代葡萄糖作為碳源以增加細胞中海藻糖的含量。也有研究表明冷凍前溫和的熱處理可使酵母菌菌體內海藻糖含量增加,而當酵母菌處于厭氧環境中生長時,它的海藻糖含量和抗凍能力降低[26]。Li等研究,使用5g/100mL或10g/100mL的海藻糖作為保護劑,與高含量的細胞內海藻糖相互作用,可使羅倫隱球酵母(Cryptococcuslaurentii)和粘紅酵母(Rhodotorulaglutinis)兩類拮抗酵母菌的存活率分別達到90%和97%左右[24]。

1.3 按保護劑的穿透能力進行分類

按保護劑的穿透能力可將保護劑分為三類:能夠穿透細胞壁和細胞膜的保護劑、能夠穿透細胞壁而無法穿透細胞膜的保護劑、既不能穿透細胞壁又不能穿透細胞膜的保護劑。穿透能力的不同反過來會影響它們對微生物的保護機制,保護作用大致可分為細胞內保護和細胞外保護[18]。此種分類方法最初是用來分類冷凍保護劑的。

能夠穿透細胞壁和細胞膜的保護劑主要有二甲基亞砜、甘油等。二甲基亞砜和甘油是常見的冷凍保護劑,在微生物冷凍保種中發揮著重要作用。二甲基亞砜對一些生物系統具有毒性作用,毒性因微生物類別而異,在使用時,應該避免二甲基亞砜的濃度超過15%,且需要在解凍后對懸浮液進行離心或稀釋。Tan等研究表明,5g/100mL的葡聚糖+7g/100mL的海藻糖+1%的二甲基亞砜可以使多孢節叢孢(Arthrobotryssuperba)的存活率達到35%左右[17]。對于加有甘油的懸浮液很大程度上會延長干燥時間,若干燥不完全,甘油對凍干菌有負面作用[27],但也有研究得出乳酸菌在中性環境的存活率要高于酸性環境的存活率,甘油有助于克服酸性環境給乳酸菌帶來的不良影響[28]。南君勇等研究表明5%的甘油可以使熱帶假絲酵母(Candidatropical)的存活率達到28%左右[29]。此類保護劑可以在冷凍時形成玻璃態,抑制冰晶的形成,防止高滲透壓引起的鹽類毒性對細胞膜造成破壞。

能夠穿透細胞壁而無法穿透細胞膜的保護劑主要有氨基酸、分子量較小的聚合物例如PEG-1000。此類保護劑可以在細胞膜和細胞壁之間形成緩沖層,抑制冰晶的形成,保護細胞膜。有研究表明1g/100mL的PEG可以使熱帶假絲酵母(C.tropical)的存活率達到28%左右[30]。常見的氨基酸保護劑有谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、半胱氨酸等。有熒光探針檢測到當菌懸液中加入谷氨酸或天冬氨酸會使細胞磷脂膜變得無序,促使細胞膜流動性增強,干燥后存活率上升[31],Yang等研究表明0.1g/100mL的L-半胱氨酸可以使長雙歧桿菌(B.longum)的存活率達到25.54%±0.52%[19],也有研究表明天冬氨酸、脯氨酸對乳酸菌沒有保護作用[28]。

既不能穿透細胞壁又不能穿透細胞膜的保護劑主要指較高分子量的聚合物,例如蛋白質、多糖、葡聚糖等。此類保護劑可在細胞表面形成粘性層,保護細胞。Ashwood-Smith等研究認為PVP能夠與過氧化氫酶連接起到保護作用[32]。而Lodato等研究PVP對酵母菌的保護效果不佳[21]。羧甲基纖維素和羥甲基纖維素作為保護劑可為干粉提供一個較輕的多孔結構,但是不容易復水[10]。

1.4 按保護劑的保護階段進行分類

按保護劑的保護階段可將保護劑分為:冷凍保護劑、干燥保護劑、貯藏保護劑。此種分類方法是由保護劑在某個階段所起主要作用而分類的,事實上有些保護劑的保護作用是交叉的,可能在三個階段都起作用,例如海藻糖等[11]。甘油和二甲基亞砜是優良的冷凍保護劑,在微生物冷凍保種中的作用不可忽視,但隨著真空冷凍干燥技術的發展,一些冷凍保護劑被廣泛應用到凍干領域。但也有研究人員證明添加一定量的冷凍保護劑到凍干保護劑中并沒有提高真菌的存活率[17]。

一般認為冷凍保護劑和干燥保護劑在冷凍干燥的不同階段發揮主要作用,添加冷凍保護劑的作用是減少細胞內冰晶的形成,冷凍保護劑能夠促進微生物懸浮液玻璃態的形成、抑制冰晶的形成,防止形成的冰晶破壞細胞膜和蛋白質[33]。同時研究表明,干燥過程中干燥保護劑能夠取代水分子吸附在磷脂、蛋白質表面,與磷脂雙分子層相互作用,降低它從液晶相到剛性凝膠相的溫度[34]。

有些物質可阻止或降低冷凍干燥過程對微生物的不良影響,而無法在貯藏過程發揮保護作用。有研究表明,在貯藏期中,有可能因為氧化作用而對微生物存活率造成影響,因此一些抗氧化劑被用作貯藏保護劑,例如抗壞血酸鈉[22]、硫代硫酸鈉[34]等,甚至一些糖類在貯藏過程中也可起到抗氧化的作用,Benaroudj等研究海藻糖可作為自由基清除劑消除氧自由基對微生物的影響[35],此外有研究證明谷氨酸鈉在凍干酵母菌貯藏過程中發揮重要作用[36]。除氧化作用對微生物存活率有影響外,高水分含量的干粉對微生物貯藏穩定性也有負面作用,相反玻璃態的形成可減弱微生物貯藏過程中生化反應的發生,而糖類可以促進干粉玻璃態的形成,這也是糖類成為貯藏保護劑的原因之一[37]。

綜合以上幾種分類方法,一個優良的保護劑首先要能夠使凍干的菌種達到一定的存活率,同時要保證凍干后菌種的功能性不會減弱,例如拮抗酵母菌分泌胞外水解酶的能力、發酵劑的發酵能力、益生菌分泌抗菌物質的能力[24,38]等,其次還要求加入保護劑后懸浮液能夠在一定的時間內凍干,并且容易復水[27],再者應確保保護劑本身不具有毒性、不易分解,此外對于要進行商業化應用的凍干制劑,還應該考慮保護劑的成本問題。

2 常用的幾種保護劑及保護機理

保護劑的選擇很大程度上取決于微生物的種類,但也有一些保護劑是適用于很多種微生物的,這其中包括脫脂奶粉、海藻糖、蔗糖、乳糖、谷氨酸鈉等。

2.1 脫脂奶粉的保護機理及應用

脫脂奶粉是一個混合物,它包括乳糖、蛋白質、鹽類、維生素等。脫脂奶粉中的蛋白質為細胞提供了一個保護性外膜[9],經研究證明其中的Ca2+可以提高微生物冷凍干燥后的存活率,此外脫脂奶粉中的磷酸鹽和檸檬酸鹽可以起到緩沖作用,穩定pH[23]。

但其實也有研究表明,單獨使用脫脂奶粉作為保護劑微生物的存活率并不是很高,Berny等研究使用脫脂奶粉作為保護劑,釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)存活率是30%左右,酒香酵母(Brettanomycesbruxellensis)的存活率較低,而對葡萄串狀節叢孢(Arthrobotrysarthrobotryoides)沒有起保護作用[10]。所以很多研究者認為脫脂奶粉能被廣泛應用,是因為它可作為一種賦形劑,為干粉提供較輕的多孔無定型結構,容易復水[7]。在很多研究中,采用高濃度的脫脂奶粉和其他物質復合來提高微生物的存活率。Polomska等研究凍干酵母菌,單獨使用10g/100mL的脫脂奶粉,球形假絲酵母(Candidasphaerica)的存活率是20%左右,當10g/100mL的脫脂奶粉+10g/100mL的谷氨酸鈉作為保護劑,它的存活率達到50%左右,當10g/100mL的脫脂奶粉+10g/100mL的海藻糖或10g/100mL的脫脂奶粉+10g/100mL的海藻糖+10g/100mL的谷氨酸鈉作為保護劑,它的存活率達到80%左右[38]。

2.2 海藻糖的保護機理及應用

海藻糖能夠有效提高微生物凍干后的存活率,曾在很長一段時間被認為是為微生物提供碳源[35],然而更多的研究結果表明,海藻糖在穩定細胞膜結構和蛋白質結構方面起著重要作用,而細胞膜物理狀態的改變以及蛋白質的變性是造成微生物死亡的直接原因[39]。

海藻糖的保護機理主要體現在兩方面,首先在凍干過程中,細胞內冰晶的形成破壞細胞膜、造成胞內滲透壓上升、胞內溶質濃度升高產生毒副作用,海藻糖的加入可提高菌懸液的玻璃化轉變溫度,使菌懸液形成玻璃態[37],敏感性物質嵌入到玻璃態中[21],同時分子移動性降低,對酶也有很好的保護作用[34]。此外根據水代替假說[11],在凍干過程中,海藻糖能夠代替水分子與細胞膜和蛋白質上的親水基團形成水合鍵,保持蛋白質結構和功能的穩定,避免細胞膜失水后,烷基鏈聚合,使細胞膜從片狀轉為凝膠狀或六角狀,造成細胞內物質的泄露[33]。Cerrutti等研究表明內源性海藻糖的保護原理也與細胞膜穩定性、酶活力的保存有關,而對酵母菌來說干燥后其存活率在很大程度上取決于細胞內的海藻糖含量[40]。

Yang等對長雙歧桿菌(B.longum)研究,發現單獨使用保護劑時,10g/100mL的海藻糖的保護效果最好,其存活率達到53.22%±2.21%[19]。很多研究認為海藻糖的保護性能優于蔗糖[41],這主要也是由于海藻糖的玻璃化轉變溫度高于蔗糖,海藻糖還可以形成二水化合物,因此懸浮液中少量水可以被析出,使得剩余的物質形成玻璃態[12],Patist等還表示,與蔗糖和麥芽糖相比,海藻糖兩個單體之間的伸縮性、柔韌性更好,因而與大分子的極性基團相互作用也更強,再者海藻糖能夠瓦解水的四面體結構,減少結晶水的形成[33],但是海藻糖的成本在一定程度上限制了它的使用。

2.3 谷氨酸鈉的保護機理及應用

谷氨酸鈉作為凍干保護劑其應用遠沒有脫脂奶粉和海藻糖廣泛,然而谷氨酸鈉獨特的保護機理也受到很多研究者的青睞。曾有研究人員對氨基酸進行大量研究,認為谷氨酸中的-NH2、α-COOH和γ-COOH對微生物起到保護作用,在干燥過程中,谷氨酸鈉與水的密切作用使干粉保留了適量的水分,滿足了微生物維持生命的最低需求[42]。此外研究表明谷氨酸鈉還具有抗氧化作用,抑制三酰甘油的氧化和自由基的形成,以防止對細胞膜造成不可逆轉的破壞[38]。

有研究表明,以2.5%的谷氨酸鈉作為保護劑凍干酒類酒球菌(Oenococcusoeni),貯藏6個月后的存活率與凍干后直接測得的存活率分別是71.3%和72.4%,表現出較好的貯藏穩定性[15]。但也有研究表明,單獨使用谷氨酸鈉對微生物保護作用不大,王華等研究熱帶假絲酵母(C.tropical)發現,當使用7g/100mL的谷氨酸鈉作為保護劑,該菌的存活率為27.92%,采用響應面法得出14.15g/100mL的蔗糖+7.07g/100mL的谷氨酸鈉+1.1g/100mL的聚乙二醇為保護劑,它的菌體存活率可達到81.46%[30]。

3 保護劑的增效途徑

對于單個保護劑的增效途徑,首先可通過大分子保護劑與小分子保護劑結合、滲透性保護劑與非滲透性保護劑結合、糖類保護劑與蛋白類保護劑結合等理論復合保護劑使其達到增效、協同的作用[1,18]。南君勇研究熱帶假絲酵母(C.tropical),通過單因素、正交實驗,當使用5%的甘油+5g/100mL的脫脂奶粉+10g/100mL的蔗糖+15g/100mL的β-環狀糊精可使該菌的存活率達到82.86%左右[29]。Li等研究表示,用檸檬酸取代葡萄糖培養酵母菌可使酵母菌體內產生大量的海藻糖,再另加10g/100mL半乳糖和5g/100mL脫脂奶粉作為保護劑,其存活率可達到96.1%±2.5%[25]。Huang等通過響應面法,得出德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii)的最佳保護劑是6.64g/100mL的蔗糖+10.12%的甘油+11.3g/100mL的山梨糖醇+13g/100mL的脫脂奶粉,它的存活率可達到86.53%[7]。

此外保護劑還可以與無機鹽類混合,以提高微生物的存活率。研究表明對于某些病毒、嗜鹽微生物,添加Mg2+和Ca2+等可以顯著提高存活率,然而對于某些真核微生物通常會造成滲透壓傷害[18]。Conrad等研究表明,添加硼酸鹽到海藻糖中能夠有效提高嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)的存活率,硼酸鹽分子與海藻糖分子相互纏結,形成類似多聚物的分子,提高海藻糖的玻璃化轉變溫度,與小分子結合,在冷凍和干燥過程中保護酶[34]。而Tan等研究人員表示添加CaCl2、MgSO4到葡聚糖和海藻糖中,沒有提高多孢節叢孢(A.superba)的存活率[17]。

大量研究表明,預先將微生物暴露在較溫和的惡劣環境中可以增強它在后續相同極端環境或另一類極端環境中的抗逆能力,這種現象稱為獲得性抗逆能力或交叉保護能力,微生物常見的抗逆能力主要體現在它對冷、熱、酸的應激反應[26]。Diniz-Mendes等研究,釀酒酵母(S.cerevisiae)冷凍前在40℃的條件下熱浴60min,貯藏7d后與對照組相比,其存活率提高了7倍,究其原因可能是冷凍前的熱處理使酵母菌菌體內產生抗熱蛋白和海藻糖,此外該菌冷凍前在10℃條件下放置3h也可提高凍干存活率,但其原因與熱處理不同,具體保護機理還有待進一步研究[43]。Benaroudj等也得出類似結論,釀酒酵母(S.cerevisiae)冷凍前,38℃熱處理或蛋白酶體抑制劑的誘導可以使酵母菌菌體內積累大量的海藻糖[35],提高其存活率。Son等表明,釀酒酵母(S.cerevisiae)分別在pH=3.5和pH=5.2的環境中培養,凍干后前者的存活率大于后者的存活率,主要原因是在低pH條件下,菌體糖原增多、飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的比例上升,能夠使細胞膜保持最佳的膜質秩序[26]。

4 展望

保護劑的選擇是微生物真空冷凍干燥過程中極其重要的環節,它的保護效力因微生物而異,這種差異不僅表現在細菌和酵母菌之間,甚至酵母菌的不同種間也存在區別,同時在研究過程中,也應關注微生物的初始濃度、保護劑的濃度、干粉的貯藏溫度、干粉的復水等才能較好的維持它的保護效力。未來保護劑的發展趨勢主要有如下幾方面:應用差示量熱掃描儀、近紅外光譜儀、掃描電鏡等儀器測定保護劑的玻璃化轉變溫度、觀察保護劑玻璃態的形成,輔助判斷它們的保護能力[2,13,21,44];保護劑可以不僅僅局限在菌懸液凍干前添加,已有較少的研究證明,在培養基或干粉復水時添加保護劑,可以分別增強菌種的抗逆能力和修復能力[8,11,25];使用細胞固定技術、微膠囊技術,將海藻酸鈉、果膠等保護劑應用到凍干制劑中,增強菌種的穩定性[45-46];篩選特殊的保護劑,使其既能夠保護菌種,又能夠發揮與菌種相似的作用,例如可以選擇一種生物保鮮劑作為凍干拮抗酵母菌的保護劑,一舉兩得。

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Application of protectants in freeze-dried microorganism

NIU Xiao-ying1,DENG Li-li1,ZENG Kai-fang1,2,*

(1.College of Food Science,Southwest University,Chongqing 400715,China;2.Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Agro-products on Storage and Preservation(Chongqing)Ministry of Agriculture,Chongqing 400715,China)

The lower viability of freeze-dried microorganism restricts the development and application of fruits and vegetables biocontrol agents,probiotics and starter cultures in some extent,but adding the appropriate protectants can compensate such deficiency widely. This paper summarized the application of protectants in lyophilization,and classifies the protectants from different angles,such as chemical structure,source,permeability,protective phase,and selects some common protectants,such as skimmed milk powder,trehalose,sodium glutamate,to illustrate their protective mechanism and applications. Besides,the paper introduced symergistic methods of protectants to show that using only one protectant during freeze-drying can not achieve ideal viability and the synergism of different protectants will make the commercialization of biocontrol agents and starter cultures possible.

freeze-drying;protectant;protective mechanism;synergistic methods

2014-05-28

牛曉影(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：食品生物技術。

*通訊作者:曾凱芳(1972-)，女，博士，教授，研究方向：農產品加工與貯藏工程。

國家自然科學基金項目(31271958)；重慶市科技攻關(應用技術研發類/重點)項目(cstc2012gg-yyjsB80003)；教育部留學回國人員科研啟動經費(45批)。

TS201.1

A

1002-0306(2015)01-0390-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.074