液相色譜—串聯質譜檢測田七花總皂苷中三七皂苷R1的含量

陳玉勇　秦楓　朱善元　黃文強　卞歡

摘要：建立了檢測田七花總皂苷中三七皂苷R1含量的高效液相色譜-串聯質譜（HPLC-MS/MS方法。用BDS HYPERSUL C18（150 mm×21 mm，5 μm色譜柱，以乙腈-水為流動相進行梯度洗脫，流速03 mL/min，柱溫30 ℃；質譜分析采用三重四桿質譜儀，多反應檢測（MRM模式，[JP2]電噴霧離子源（ESI負離子檢測，定量分析的離子為：三七皂苷R1 m/z 9317→7996，內標物紫杉醇m/z 8525→5253。三七皂苷R1標準曲線的線性范圍為00476～119 μg/mL，平均加樣回收率為9933%，RSD為165%（n=6。精密度、穩定性、重現性均符合樣品分析的要求。

關鍵詞：田七花；三七皂苷R1；高效液相色譜-串聯質譜

中圖分類號： Q94683+84；O65763文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（201412-0319-03[HS][HT9SS]

收稿日期：2014-07-07

基金項目：江蘇省高校“青藍工程”科技創新團隊資助項目；江蘇省泰州市科技支撐（農業計劃（編號：TL0719。

作者簡介：陳玉勇（1978—，男，江蘇泰州人，博士研究生，講師，主要從事食品生物技術、食品分析等研究。E-mail：chenyuyong@tomcom。

通信作者：秦楓，碩士，副教授，從事天然藥物及食品新資源開發等方向研究。E-mail：qinancy922@tomcom。

田七花為五加科植物田七[Panax notoginseng （Burk FH]的干燥花蕾，田七花作為云南文山州的傳統生物資源，廣泛應用于食品、保健品以及中藥藥材。例如，當地常用田七花泡茶[1]，制作點心，或與其他食材一起制成滋補品，長期食用對于治療高血壓、咽痛音啞和養生都頗有裨益[3-4]。田七花中含有皂苷、多糖、揮發油等多種化學成分，其中，皂苷是其主要生理活性成分，楊明晶等發現田七花苷沒有毒性作用[7]，故近年來，將田七花進一步開發為保健品的研究較為熱門。Yang 等已經從田七花中鑒定出170種單體皂苷，發現三七皂苷R1是皂苷中的一種主要成分[8]。目前，關于田七花中三七皂苷R1含量檢測的方法有比色法[9]和HPLC法[10-11]等，但是比色法只能檢測其中總皂苷的含量，HPLC法運行時間一般在15 min以上，且靈敏度低、專屬性差。因此，筆者參照文獻[12]對試驗條件進行優化，建立了 HPLC-MS/MS 分析方法，該法能夠靈敏地檢測田七花蕾中三七皂苷R1的含量，可為三七花總皂苷（SFPN和以其為主要成分的保健食品的含量檢測提供一定參考。

1材料與方法

11儀器

三重四桿質譜儀（API 4000型，配有電噴霧離子源（ESI，采用美國ABI公司的Analyst 141 數據分析系統；高效液相色譜儀（美國Agilent 1100；Q2200B型超聲波清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司；HH-S數顯恒溫水浴鍋（浙江省金華市文華科教實驗儀器廠；RE-3000旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠；SH-Ⅲ型循環水真空泵（上海亞榮生化儀器廠；Direct-Q3型超純水機（江蘇省蘇州塞恩斯儀器有限公司。

12對照品與試劑

三七皂苷R1（批號：110745-201318，由中國藥品生物制品檢定所提供。紫杉醇（批號：100382-201201，購自云南省昆明科翔生物科技有限公司。田七干燥花蕾，由云南省文山壯族苗族自治州文山三七研究院提供。

D101大孔樹脂購自江蘇省泰州醫藥公司。乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，其余均為分析純試劑。

13HPLC-MS/MS分析條件

131高效液相色譜條件

色譜柱為 BDS HYPERSUL C18（150 mm×21 mm，5 μm；流動相為水（A和乙腈（B，流速為[CM（25][G5]03[G2]mL/min，柱溫為[G5]30[G2]℃，進樣量為[G5]10[G2]μL。梯度洗脫方[CM]

[HS2]式為流動相B：20%[FY（]2 min[FY]30%[FY（]5 min[FY]75%[FY（]10 min[FY]90%。

132質譜條件

采用電噴霧離子源（ESI負離子檢測，多反應檢測模式（MRM。設制離子噴霧電壓（IS為4 100 V；離子源霧化溫度（TEM為450 ℃；去集簇電壓（DP為-105 V；激發碰撞電壓（CE為-47 V。采用的定量分析離子為：三七皂苷R1 m/z 9317→7996；內標物紫杉醇m/z 8525→5253。

14樣品處理

141對照品及內標溶液的配制

稱取三七皂苷R1 119 mg，[JP+1]以甲醇定容至10 mL，得到對照品儲備液。稱取紫杉醇101 mg，以甲醇超聲溶解，定容至10 mL，再取該溶液100 μL以甲醇定容至10 mL，渦旋振蕩溶解，即得內標溶液。

142供試品溶液的制備

參照Sun等的方法[13]，制備田七花總皂苷（SFPN。將田七干燥花蕾1 kg粉碎，過20目篩，以10倍質量70%乙醇回流提取3次，每次提取15 h。合并提取液，減壓濃縮，并以適量水混懸，再分別以乙醚、正丁醇萃取，棄去醚層，收集正丁醇層，減壓濃縮，抽干溶劑。將正丁醇萃取物經D101大孔樹脂先以水洗脫，棄去洗脫液，再以90%乙醇洗脫，收集洗脫液，于45 ℃左右減壓濃縮至干燥固態，即為田七花總皂苷（SFPN。共制備了5個批次的SFPN（批號分別為20130502、20130816、20130902、20131011、20131112。

稱取對應批號的SFPN粉末02 g，加甲醇定容至10 mL，超聲輔助溶解，得供試品儲備液。取內標溶液100 μL和供試品儲備液100 μL，加甲醇定容至1 mL，渦旋振蕩溶解，經 045 μm 微孔濾膜過濾，得供試品溶液。endprint

2結果與分析

21方法的專屬性和特異性

按“13”節中液相色譜和質譜條件對SFPN中三七皂苷R1進行測定，記錄色譜圖。圖 1為對照品和內標物總離子流圖，圖2為SFPN和內標物的總離子流圖。在選定色譜條件下，被分析的化合物三七皂苷R1和內標物紫杉醇分別在約618 min和935 min時出峰，對照品和內標物的峰形和分離度較好，靈敏度強；同時采用保留時間和離子對的響應強度來進行分析，更有效避免了其他物質對這種皂苷測定的干擾，具有較好的專屬性和特異性。[FL]

[F（W14][TPCYY1tif][F]

[F（W14][TPCYY2tif][F]

[FL（22]

22標準曲線與線性范圍考察

以對照品儲備液和內標溶液來配制不同濃度對照品溶液，將三七皂苷R1的濃度分別調至0047、0119、0476、119、476、119 μg/mL，進樣量為10 μL。以對照品濃度為橫坐標，以樣品峰和內標峰面積之比為縱坐標，制作回歸曲線，用加權（W=1/C2最小二乘法進行回歸分析[14]，求得直線回歸方程為y=33x+0027 8，相關系數（r為0999 8，線性范圍為0047 6～119 μg/mL。

23精密度試驗

對照品溶液連續六針進樣，每次進樣10 μL，進行精密度試驗。計算對照品的峰面積和內標峰面積的比值，并統計出比值的RSD為185%，表明儀器精密度較好。

24穩定性試驗

量取供試品溶液10 μL，分別在0、8、16、24 h時進樣測定，計算對照品峰面積和內標峰面積的比值，并統計出比值的RSD為193%，表明在24 h之內供試品溶液的穩定性較好。

25重現性試驗

取批號為20130902的SFPN樣品，制備6份供試品溶液，[JP2]按“13”節的條件對樣品中三七皂苷R1的含量進行檢測。計算出樣品的峰面積和內標峰面積的比值，并代入“22”節的回歸方程，計算出三七皂苷R1的平均含量為056 mg/g，并統計出含量的RSD為159%，表明本方法具有較好的重現性。

26加樣回收率試驗

稱取批號為20131011的已知含量的SFPN樣品6份，每份02 g，按上述方法，制備樣品儲備液，取100 μL內標溶液和100 μL的供試品儲備液，加入適量的對照品儲備液，加甲醇定容至1 mL，溶解后，過045 μm微孔濾膜，得到供試品溶液，按上述方法操作，計算供試品溶液中三七皂苷R1的含量，計算回收率和RSD，結果見表1。

[F（W10][HT6H][J][WTH]表1三七皂苷R1的回收率測定結果（n=6[HTSS][STB][WTB]

[HJ5][BG（！][BHDFG3，W3，W42。5，W32W]樣品號稱樣量（mg樣品含量（μg/mL加入量（μg/mL測得量（μg/mL回收率（%RSD（%

[BHDG12，W3，W42。5DW，W32W]1200111121122209821

[BHDW]22000611211222810179

320026112112229821

4200151121122229911

51999211211222610089

6199791121122199777

平均9933165[HJ][BG）F][F）]

27樣品含量測定

稱取不同批號的SFPN樣品3份，每份02 g，制備供試品溶液，按“13”節色譜條件進行操作，計算出樣品的峰面積和內標峰面積的比值，并代入“22”節的回歸方程，計算三七皂苷R1含量，結果見表2。

[F（W6][HT6H][J][WTH]表2田七花總皂苷中三七皂苷R1的含量（n=3[HTSS][STB][WTB]

[HJ5][BG（！][BHDFG12，W14，W15W]SFPN批號三七皂苷R1（mg/g

[BHDG12]20130502057

[BHDW]20130816055

20131112051[HJ][BG）F][F）]

3討論

田七花的組成成分復雜，含有大量色素，在測定三七皂苷R1時，必須排除主要基質成分或色素成分的干擾。本研究參照Sun等所述方法[13]，以乙醚萃取去除葉綠素等脂溶性物質，以正丁醇萃取出大部分的皂苷類物質，再選用D101型大孔樹脂進行柱層析，用水洗去多糖，最后收集90%乙醇洗脫液，此法可較好地對田七花皂苷類成分進行富集和純化。

三七皂苷R1的最大吸收波長為203 nm，由于SFPN含有多種成分，紫外末端吸收多，采用普通的HPLC紫外檢測器難以進行高靈敏度的檢測，且專屬性較差。皂苷類化學成分極性大、難揮發、熱不穩定，經典的電子轟擊電離（EI對其進行結構分析也很困難。使用ESI同時結合二級質譜分析，可以較快地獲得結構信息。在選定內標物時，發現紫杉醇純度高、易保存，與被測成分的化學性質相似，有較好的質譜響應，穩定性好，內源物質無干擾。本研究建立的采用負離子多反應監測技術的HPLC-MS/MS分析方法，靈敏度高、重現性好，符合食品樣品分析的要求，較其他方法節省了大量的時間和成本[14]，可用于三七皂苷R1的定量分析，為不同田七花及其保健食品、藥品的含量測定提供方法學參考。

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