烏頭堿抗血清制備與鑒定

郭方超 肖文華 崔平福 王永娟

摘要：通過活性酯法將小分子的烏頭堿（ACO偶聯到牛血清白蛋白（BSA、雞卵清白蛋白（OVA上，形成偶聯物ACO-BSA、ACO-OVA。以ACO-BSA為免疫原，ACO-OVA為檢測原，通過ELISA法檢測ACO-BSA免疫鼠血清效價，間接競爭ELISA法檢測抗體特異性、最低檢測限。結果表明，免疫原和檢測原均偶聯成功，血清效價均大于 12 800。間接競爭ELISA法檢測結果表明，所獲抗體對ACO特異性強，最低檢出限為1 ng/mL，IC50值為30 ng/mL，檢測范圍為1～6 μg/mL。

關鍵詞：烏頭堿；活性酯法；完全抗原；抗血清；牛血清白蛋白；雞卵清白蛋白

中圖分類號： S8544+3文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（201412-0336-03[HS][HT9SS]

收稿日期：2014-04-28

基金項目：江蘇農牧科技職業學院重點支持項目（編號：NSFD1305、D1204。

作者簡介：郭方超（1982—，男，江蘇徐州人，實驗員，從事臨床獸醫學研究。E-mail：445785442@qqcom。

通信作者：王永娟，博士，副教授，從事動物疫病防控研究。E-mail：43088591@qqcom。

烏頭堿（aconitine，ACO是存在于川烏、草烏、附子等植物中的主要有毒成分，也是發揮部分藥效的主要有效成分。現代藥理研究表明，烏頭類有毒中藥如烏頭、附子具有多種藥理作用，主要表現為強心抗休克、抗心律失常、抑制呼吸中樞等[1-2]。ACO在強心、鎮痛、抗腫瘤、調節免疫等方面已顯示了良好的療效。烏頭堿的毒性經過炮制后會大大降低，然而臨床上經常出現因炮制不當或服用過量導致患者中毒死亡的報道，一般認為口服烏頭堿02 mg 即可引起中毒，2以上則有致死性。 為了保障ACO制劑的質量及用藥安全，必須對ACO限量進行測定。精準把控烏頭屬中藥材應用時的療效與安全性，精確快速檢測藥物或生物材料中ACO的含量，一直是烏頭屬中藥材研究的難點。本試驗對ACO完全抗原的合成條件進行了研究，旨在為ACO快速定量檢測試劑盒開發提供依據。

1材料與方法

11材料

牛血清白蛋白（BSA、卵清白蛋白（OVA、1-（3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC、二甲基甲酰胺（DMF、N-羥基琥珀酰亞胺 （NHS、辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑均購于Sigma公司；其他試劑均為國產分析純；烏頭堿（ACO樣品購自成都瑞芬斯生物科技有限公司；96孔可拆酶標板、低溫高速離心機、U-2901型紫外、可見及近紅外分光光度計均購自日本HITACHI公司；ELX800型酶標儀、ELX50型自動洗板機均購自美國BioTek公司；超純水制備儀購自美國Millipore公司；Balb/C雌性小鼠購自揚州大學比較醫學中心。

12完全抗原制備與鑒定

121完全抗原的合成

采用改進后的N-羥基琥珀酰亞胺活性酯法[4-5]，分別合成免疫原ACO-BSA、包被抗原 ACO-OVA。精確稱取 10 mg ACO標準品、5 mg NHS、5 mg EDC充分溶解于1 mL DMF及200 μL雙蒸水中，室溫下避光攪拌，過夜反應得恩諾沙星的反應液A，按此法再制得第2份反應液A；精確稱取 25 mg BSA溶于3 mL PBS（pH值為 74中，另稱取18 mg OVA溶于3 mL PBS（pH值為 74中，此溶液為B液。將上述反應液A逐滴加入B中，要求每5 min～10 加入200 μL，15 h內操作完畢。用透析袋、離心機初步純化完全抗原。

122 偶聯抗原濃度測定與鑒定 配制不同濃度的BSA標準品，BCA法測定吸光度并制作標準曲線；進而測定合成的偶聯抗原濃度。同時，以PBS為空白，采用紫外光譜掃描，波長范圍為230～300 nm，檢測偶聯情況。

13 動物免疫

對6～8周齡小鼠隨機多點注射ACO-BSA，每只 05 mL，每2周免疫1次，共免疫5次。首次免疫使用等量弗氏完全佐劑乳化抗原，之后3次加強免疫時免疫原與弗氏不完全佐劑乳化；第3次加強免疫4 d后，眼眶靜脈采血，ELISA方法檢測小鼠免疫血清效價。選擇血清效價高且敏感性好的小鼠進行沖擊免疫，免疫途徑為腹腔注射，劑量為初免劑量（不加弗氏佐劑）。同時設陰性對照小鼠。

14血清效價檢測

每孔包被005 mg/mL ACO-OVA 100 μL，試驗組血清抗體從1 ∶[G-3]100開始倍比稀釋，采用間接ELISA方法檢測血清效價最高的小鼠。

15ACO-OVA最佳工作濃度確定

包被抗原ACO-OVA從20 μg/mL開始倍比稀釋，免疫血清從1 ∶[G-3]100開始倍比稀釋，按間接ELISA操作步驟進行試驗。以抗體稀釋倍數為橫坐標，D450 nm值為縱坐標作曲線，考察不同包被抗原濃度曲線的平滑度。以D450 nm值為10左右對應的抗原濃度作為最佳包被濃度。

16抗體敏感性測定（Ci-ELISA法

配制一系列濃度的ACO標準品溶液作為競爭品，血清抗體濃度按上面步驟確定的抗體最佳工作濃度。按間接競爭ELISA法步驟進行試驗，計算抑制率。

2結果與分析

21人工抗原紫外光譜鑒定

由圖1、圖2可知，偶聯抗原的最大吸收波長發生紫移，且ACO-OVA的全波長掃描曲線與ACO、OVA曲線不同，說明人工抗原合成成功，同理可以判定人工抗原ACO-BSA偶聯成功。

[F（W10][TPGFC1tif][F]

[F（W10][TPGFC2tif][F]

22偶聯比的計算

ACO與載體蛋白BSA、OVA偶聯比的計算公式如下[5]：

[HS2][J][SX（]nanb[SX]=[SX（]（DCam×DBbm-DBam×DCbm×Ca（DCbm×DAam-DAbm×DCam×Cb [SX]。

式中：na/nb為偶聯物中ACO與載體蛋白BSA或OVA偶聯的物質的量比；DCam為偶聯物在ACO最大吸收波長處的吸光度；DBbm為BSA或OVA在其最大吸收波長處的吸光度；DBam為BSA或OVA在ACO最大吸收波長處的吸光度；DCbm為偶聯物在BSA或OVA最大吸收波長處的吸光度；DAam為ACO在其最大吸收波長處的吸光度；DAbm為ACO在BSA或OVA最大吸收波長處的吸光度；Ca為ACO標準物的濃度；Cb為BSA或OVA標準物的濃度。經計算ACO與BSA的偶聯比為22 ∶[G-3]1，ACO與OVA的偶聯比為16 ∶[G-3]1。

23BCA法測定蛋白濃度

利用BCA法測定不同濃度標準品的吸光度，并制作標準曲線（圖3）。根據標準曲線，測得ACO-BSA的濃度為 377 mg/mL，ACO-OVA的濃度為324 mg/mL（表1。

[F（W10][TPGFC3tif][F]

[F（W9][HT6H][J]表1合成抗原濃度測定[HTSS][STB]

[HJ5][BG（！][BHDFG3，W11，W9。2W]樣品編號 吸光度 濃度（mg/mL

[BHDG12]ACO-BSA-10713382

[BHDW]ACO-BSA-20691371

ACO-BSA平均值377

ACO-OVA-10623334

ACO-OVA-20586314

ACO-OVA平均值324[HJ][BG）F][F）]

24間接ELISA檢測血清效價

根據表2的數據，計算陽性小鼠的血清效價，每個小鼠的血清效價均大于12 800，第5個小鼠的血清效價最高。判斷的標準為：P/N>21，且P>02，其中P=陽性值-陰性值，N=陰性值-空白值。[FL]

[F（W+49mm][HT6H][J][WTH]表2Ci-ELISA血清效價檢測[WTB][HTSS][STB]

[HJ5][BG（！][BHDFG3，W22/5，W573/5W]小鼠分組[B（][BHDWG12，W573/5W]吸光度[BHDWG12，W44/5。12W]列1列2列3列4列5列6列7列8列9列10陰性血清空白對照[BW]

[BHDG12，W22/5，W44/5。12W]A046304670489049004780460041203520301023501300020

[BHDW]B049104710491048804710444041603660299022501110022

C049204970499050104920472046104210394023901200024

D048204960506048804790477045504070389024101070022

E052705040498049104830468044903830412023101040025

F047304690483048304850448042303840325022401020021[HJ][BG）F]

注：列1、列2、列3、……、列10分別為稀釋100×20、100×101、100×102、……、100×109倍。[F]

[FL（22]25方陣滴定法選擇ACO-OVA包被吸光度濃度和抗血清的最佳工作濃度

由表3可知，最佳抗原包被濃度為25 μg/mL，對應的抗體稀釋倍數為12 800。

26血清抗體敏感性測定

通過添加不同濃度ACO競爭品，所得線性回歸方程y=-9016lnx+109223（r2=0992 7，IC50值為30 ng/mL，根[CM（25]據回歸公式計算，抗體對ACO的檢測范圍（IC20～IC80為[CM][FL]

[F（W12][HT6H][J][WTH]表3抗血清最佳工作濃度和ACO-OVA包被濃度測定[WTB][HTSS][STB]

[HJ5][BG（！][BHDFG3，W5，W55W][JP3]ACO質量濃度（μg/mL[B（][BHDWG12，W55W]吸光度[XXSX2-SX542]列1列2列3列4列5列6列7列8列9列10[BW]

[BHDG12，W5，W52。10DWW]203125302630982947295528252791279928130288

[BHDW]103056300829862871269525712431243324560144

53018295829722648233119551781169217210186

253047286728342214163812261063101809700234

1252975280124031491090507150641056107900180

06252857253718920977060904950375036604960229

03122452189010260598033902250186016201840214

01562129156309350451025902830241021002870252[HJ][BG）F]

注：列1、列2、列3、……、列10分別為稀釋100×20、100×101、100×102、……、100×109倍。[F]

[FL（22]1～6 μg/mL，最低檢測限為1 ng/mL。

3結論與討論

ACO是小分子化合物，只具有反應原性，沒有免疫原性，只有在與大分子的載體蛋白偶聯后才成為完全抗原而具有免疫原性、反應原性。據報道，BSA、OVA中分別有60、20個游離氨基[6]，有利于ACO與載體蛋白的偶聯作用。本試驗采用改進后的N-羥基琥珀酰亞胺活性酯法，首先將ACO分子與EDC反應活化羧基，過夜后，短時間內緩慢加入蛋白反應物，這樣可以減少蛋白質間的交聯。偶聯抗原鑒定時，雖然SDS-PAGE技術是偶聯抗原常用的技術，但ACO分子量相對于BSA、OVA分子量而言較小，所以，不適宜用SDS-PAGE電泳分析，以通過遷移距離的變化來判斷偶聯是否成功。本試驗選擇了人工抗原紫外光譜鑒定法，取得了很好的鑒定效果。基于抗體與抗原或半抗原之間的高度特異性及敏感性而建立起來的免疫分析法簡單、快捷、經濟，被廣泛應用于生化檢測方面，在中藥質量控制領域鮮有報導。對于天然產物中含量低的物質，定量分析比較困難，目前采用的HPLC法或LC-MS法對儀器要求很高，前期處理工作復雜，檢測靈敏度無法滿足痕量檢測的要求[7]。免疫分析法已逐步應用到微量痕量中藥成分的定性定量分析、中藥成分的體內藥物代謝動力學研究中。擁有特異性ACO抗體是免疫分析法檢測ACO的基礎，因此，制備具有免疫原性的ACO抗原對于ACO檢測具有重要意義。

[HS2][HT85H]參考文獻：[HT8SS]

[1][（#]陶長戈，李文軍，彭成 烏頭堿在大鼠體內的毒代動力學研究[J] 湖北中醫藥大學學報，2011，13（3：21-23

[2]楊姝，金振輝，羊曉東，等 烏頭屬植物的化學成分及藥理作用研究進展[J] 云南農業大學學報：自然科學版，2007，22（2：293-295，298

[3]王東青，張亞麗應高度重視烏頭類中藥的毒副作用[J] 國醫論壇，2009，24（2：37-38

[4]Watanabe H，Satake A，ido Y，et al Monoclonal-based enzyme-linked immunosorbent assay and immunochromatographic assay for enrofloxacin in biological matrices[J] The Analyst，2002，127（1：98-103

[5]于洪俠，楊曙明 萊克多巴胺人工抗原的合成與鑒定[J] 中國獸醫科技，2005，35（12：1000-1003

[6]Hourwitz F The chemistry and function of protein[M] New York：Academic Press Inc，1963：190

[7]秦利芬，楊玉琴 不同采收期的附子中3種烏頭堿的含量比較[J] 微量元素與健康研究，2012，29（6：31-32[HJ][FL]

[F（H0267。54Q]更正：《江蘇農業科學》2014年第42卷第8期169-171頁所刊論文《紫斑牡丹雜交授粉后胚珠的形態學觀察》，漏登了通信作者。該文通信作者為：鞠志新，博士，教授，碩士生導師，從事觀賞植物教學與研究工作。E-mial：jilinju@126com。特此更正，并向作者和讀者致歉。