整合素αvβ3拮抗劑SB—273005對C6膠質瘤細胞talin、survivin蛋白表達及磷酸化的影響

尚發軍++++++艾文兵++++++熊志云++++++馮定坤++++++彭智

[摘要] 目的 檢測整合素αvβ3拮抗劑SB-273005對C6神經膠質瘤細胞talin、survivin蛋白表達量及其磷酸化的影響。方法將C6細胞常規培養后，分對照組（0 mg/L）、SB-273005低濃度組（25 mg/L）和SB-273005高濃度組（50 mg/L）3組，采用western法檢測不同濃度的SB-273005對C6細胞踝蛋白（talin）、生存素蛋白（survivin）表達量以及其磷酸化的變化，并檢測各組蛋白條帶光密度變化。 結果 不同濃度的SB-273005均能明顯降低C6細胞talin、survivin蛋白的表達，對二者的磷酸化有明顯的抑制作用。測得對照組、SB-273005低濃度組和SB-273005高濃度組蛋白條帶光密度，得出talin/β-actin比值分別為0.76、0.43、0.26（*P<0.05）；磷酸化的talin/β-actin比值分別為0.82、0.33、0.15（*P<0.05）。survivin/β-actin比值分別為0.84、0.21、0.09.（*P<0.05），磷酸化的survivin/β-actin比值分別為0.19、0.04、0.01（*P<0.05）。3組相比，差異有統計學意義。結論 SB-273005對大鼠C6神經膠質瘤細胞talin、survivin蛋白表達量及其磷酸化起負性調節作用。

[關鍵詞] C6神經膠質瘤細胞；踝蛋白；生存素； SB-273005

[中圖分類號] R3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2014）12（a）-0044-02

目前研究發現，在膠質瘤細胞中，talin、survivin所能發揮的生物學作用與整合素αvβ3的活性狀態密切相關[1]。talin與survivin蛋白的磷酸化水平與膠質瘤惡性程度存在關聯性，膠質瘤的惡性程度越高，二者的磷酸化水平隨之增高[2]。因此，該實驗2013年12月—2014年6月間通過采用整合素αvβ3拮抗劑SB-273005，抑制整合素活性，觀察整合素αvβ3的活性改變后與talin、survivin的表達量及其磷酸化是否存在相關性，并探討其作用機制，以期為腦膠質瘤的治療尋求更有效的方法，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗自2013年12月開始，2014年6月結束。C6神經膠質瘤細胞由南方醫科大學神經外科實驗室提供；整合素αvβ3拮抗劑SB-273005為Dupont公司產品；抗talin抗體、survivin抗體、survivin磷酸化單克隆抗體購于武漢博士德生物公司； DMEM培養基、FBS、RIPA緩沖液、TBST液、HRP-羊抗兔LgG、Rabbit Anti-β-Actin等試劑由廣州賽哲生物科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 細胞樣品制備 大鼠C6細胞常規培養，待其進入對數生長期后，調整細胞培養濃度為1×104～1×105/mL，并分為對照組（0 mg/L）、nm23-H2低濃度組（25 mg/L）和nm23-H2高濃度組（50 mg/L）3組，20 h后收集細胞樣品，加入RIPA裂解緩沖液收集裂解物，取上清備用。

1.2.2 Western Blotting 樣品行SDS-PAGE， 電轉移于PVDF膜上，牛奶封閉液封閉2～4 h，依次加入一抗（抗talin、survivin及對應磷酸化抗體1∶1 000稀釋，室溫2 h后，加羊抗兔二抗（1∶400 0），2 h后顯影。Image J軟件分析檢測各組MMP-2、磷酸化的MMP-2、β-actin平均光密度比值均數。

1.3 統計方法

采用SPSS20.0統計軟件包處理數據，所有數據以均數±標準差（x±s）表示，用 t檢驗。

2 結果

2.1 不同濃度的SB-273005均可明顯抑制C6細胞talin表達量及磷酸化

加入不同濃度的SB-273005均可明顯抑制talin表達量及磷酸化，且隨著SB-273005濃度升高，其對talin表達及磷酸化的抑制呈增高趨勢，見圖1，2，3。

2.2 不同濃度的SB-273005均可明顯抑制C6細胞survivin表達量及磷酸化

加入不同濃度的SB-273005均可明顯抑制survivin表達量及磷酸化，并且隨著SB-273005濃度升高，其對survivin表達及磷酸化的抑制呈增高趨勢。見圖4，5，6。

2.3 Image J軟件分析檢測各組MMP-2、磷酸化的MMP-2、β-actin平均光密度比值均數

Image J軟件分析檢測各組MMP-2、磷酸化的MMP-2、β-actin平均光密度比值均數，以數據表顯示。隨SB-273005處理濃度的增加，talin、survivin蛋白的表達量及磷酸化水平明顯下降，與對照組比較，差異有統計學意義（*P<0.05）；與SB-273005低濃度組比較，差異有統計學意義（△P<0.05），見表1。

表1 各組MMP-2、磷酸化的MMP-2、β-actin平均光密度比值均數

3 討論

目前研究證實，整合素αvβ3參與多條信號通路的調控，通過與ECM配體結合，促成黏著斑復合物的形成[3]。同時，該復合物所包含的配體以及其他信號分子暴露其活化位點，通過與下游的染色質片段或蛋白相互作用[4]，產生相應的生物學效應。

該研究結果顯示：各實驗組通過加入不同濃度的αvβ3拮抗劑SB-273005均能明顯降低C6細胞talin蛋白的表達，對其磷酸化有明顯的抑制作用。測得對照組、SB-273005低濃度組和SB-273005高濃度組磷酸化的talin/β-actin的平均光密度比值分別為0.82、0.33、0.15（*P<0.05）。3組相比，差異有統計學意義。國內外學者同樣證實，talin蛋白的磷酸化主要通過C-端區上的序列發揮作用，且多在細胞粘附之前，就已完成多個酪氨酸位點的磷酸化。其中，最重要的自主磷酸化部位Tyr397在這一過程中起至關重要的作用[5]。這與實驗中，磷酸化的talin的檢測結果相符。并提示talin有可能是整合素黏著斑形成初期所依賴的基礎分子，多個磷酸化位點為后期整合素相關信號通路激活發揮重要作用[6]。endprint

目前認為，整合素激活talin的可能模式是：整合素αvβ3受到信號刺激后，整合素-talin相互作用，使多個talin分子相互磷酸化而被激活。并通過對下游信號轉導分子的激活，對多條信號轉導通路予以調控，從而發揮相應生物學效應。

與talin蛋白不同，Survivin蛋白在多個腫瘤細胞中，與P53、bcl 2蛋白存在相關性。該研究結果顯示：加入各實驗組不同濃度的SB-273005均能明顯降低C6細胞survivin蛋白的表達，對二者的磷酸化有明顯的抑制作用。3組相比，差異有統計學意義。國內已經有研究證實，Survivin蛋白可以通過結合caspase家族蛋白形成的DISC和細胞色素C分別激活內源性與外源性兩條通路調控細胞的凋亡[7]。Survivin可以通過調控caspase-3 的活性導致核糖體的磷酸化，而后者可以使細胞進入周期，減少凋亡[8]。雖然三者在膠質瘤細胞的增殖和侵襲性生長等惡性生物學方面均起重要調節作用。但其具體的作用機制并不清楚。在腫瘤微環境的條件下，哪一種機制是起主導作用的，還有待進一步研究。

綜上，該研究表明整合素αvβ3拮抗劑SB-273005能有效地抑制talin、survivin表達量及其磷酸化程度，且均呈劑量依賴性抑制作用，為腦膠質瘤細胞的生物學研究提供依據，為后期中樞神經系統惡性腫瘤的治療提供新的方法。

[參考文獻]

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[2] 閆冰，任凌.黑色素瘤中整合素 αvβ3表達的研究[J].現代生物醫學進展 2014，14（27）：5210-5212.

[3] 陳靜，李建生，許戈良.肝細胞癌轉移復發預測的研究進展[J].國際外科學雜志，2013，40（5）：322-324.

[4] 尹英愛，趙樹鵬.樁蛋白和踝蛋白在甲狀腺癌中的表達及臨床意義[J].解放軍醫學院學報，2014，35（5）：481-483.

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[6] 顧美芳， 張美云， 莊訊.宮頸癌組織中survivin基因表達的臨床意義[J].南京醫科大學學報， 2008， 28（2）： 232-235.

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[8] 楊慶秋，胡偵明.整合素 αvβ3愈合過程中的表達及意義[J].中國矯形外科雜志，2012（2）：165-166.

（收稿日期：2014-08-27）endprint