大鼠BMSCs向心肌樣細胞分化過程中miR-128對Nkx2-5基因的調控作用

朱國偉，鞠延玲，高振宇(錦州市中心醫院，遼寧錦州121001)

大鼠BMSCs向心肌樣細胞分化過程中miR-128對Nkx2-5基因的調控作用

朱國偉，鞠延玲，高振宇
(錦州市中心醫院，遼寧錦州121001)

摘要:目的探討大鼠骨髓間充質干細胞(BMSCs)向心肌樣細胞分化過程中miR-128對Nkx2-5基因的調控作用。方法分離培養大鼠BMSCs，應用5-氮雜胞苷將其誘導為心肌樣細胞，采用Real-time PCR法檢測誘導6、10、14、18、22d時miR-128、Nkx2-5基因的表達。用生物信息學方法對miR-128和Nkx2-5基因的靶向匹配關系進行預測，顯示miR-128與Nkx2-5mRNA的3'UTR結合情況良好。提取心肌細胞總RNA，擴增Nkx2-5mRNA 3'UTR片段，構建Nkx2-5 3'UTR-pmirGLO熒光素酶報告載體，雙熒光素酶檢測轉染Nkx2-5 3'UTR-pmirGLO以及miR-128模擬物或對照miRNA的熒光強度，鑒定miR-128與Nkx2-5的靶向關系。結果將誘導6d的Nkx2-5和miR-128的表達量分別設為1，誘導10d的Nkx2-5表達量為4.33±1.32、22d為14.78±6.05，誘導10d的miR-128表達量為0.776 2±0.054 3、22d為0.197 6±0.083 6。miR-128與Nkx2-5的表達呈負相關(r =－0.546，P =0.021)。相對于轉染對照miRNA(設定其熒光素酶活性為1)，轉染miR-128能使Nkx2-5 3'UTR-pmirGLO的熒光素酶表達下降為0.435 4±0.072 6。結論miR-128通過結合Nkx2-5mRNA 3'UTR抑制其表達，具有負性調控BMSCs向心肌樣細胞分化過程中Nkx2-5表達的作用。

關鍵詞:微小核糖核酸; Nkx2-5基因;骨髓間充質干細胞;心肌樣細胞;大鼠

Regulatory effect ofmiR-128 on Nkx2-5 geneduring the process of rat BMSCsdifferentiating into cardiomyocyte-like cells

ZHU Guo-wei，JU Yan-ling，GAO Zhen-yu
(Jinzhou Central Hospital，Jinzhou 121001，China)

Abstract:Objective To investigate the regulatory effect ofmiR-128 on Nkx2-5 geneduring the process of rat bonemarrowmesenchymal stem cells(BMSCs)differentiating into cardiomyocyte-like cells.Methods BMSCs were isolated from bonemarrow and induced into cardiomyocyte-like cells using 5-azacytidine.The expression ofmiR-128 and Nkx2-5 wasdetermined by real-time PCR for the induction of 6，10，14，18 and 22days.Thematching relationships ofmiR-128 and Nkx2-5 gene were predicted by using bioinformaticsmethod which showed thatmiR-128 was well combined with 3'-untranslated region(3'UTR)of Nkx2-5mRNA.The total RNA of themyocardial cells was extracted.We amplified Nkx2-5mRNA 3 'UTR segment and constructed Nkx2-5 3' UTR-pmirGLO luciferase reporter plasmid.Luciferase activities of Nkx2-5 3'UTR-pmirGLO，miR-128mimics or the controlmiRNA weredetected by using thedual-luciferase assay system.The targeted relationships ofmiR-128 and Nkx2-5 were identified.Results If the expression ofmiR-128 and Nkx2-5 on the sixthday was arbitrarilydefined as 1，the expression of Nkx2-5mRNA on the tenthday was 4.33±1.32 and increased to 14.78±6.05 on the twenty-secondday.The expression ofmiR-128 on the tenthday was 0.776 2±0.054 3 anddecreased to 0.197 6±0.083 6 on the twenty-secondday.The expression ofmiR-128 was negatively correlated with Nkx2-5(r =－0.546，P = 0.021).ThemiR-128decreased the luciferase expression of Nkx2-5 3'UTR-pmirGLO to 0.435 4± 0.072 6as compared with that of the controlmiRNA(which wasdifined as 1).Conclusion ThemiR-128may inhibit the Nkx2-5 expression by combing with Nkx2-5mRNA 3'UTR，which negatively regulates the expression of Nkx2-5during the process of BMSCsdifferentiating into cardiomyocyte-like cells.

Key words:microRNA; Nkx2-5 gene; bonemarrowmesenchymal stem cells; cardiomyocyte-like cells;rats

Nkx2-5基因是心肌細胞發育過程中早期表達的轉錄因子，于心肌細胞分化前已有表達，開始見于心肌前體細胞并于心肌細胞分化階段持續表達，在胚胎和成體心肌細胞中穩定表達，是調控心肌細胞分化的重要轉錄因子［1～3］。微小RNA(miRNA)是一類小的內源性非編碼RNA，廣泛參與基因表達的調控，但miRNA參與心肌樣細胞的誘導分化的報道少見。2014年3月，我們應用5-氮雜胞苷誘導大鼠骨髓間充質干細胞(BMSCs)分化為心肌樣細胞，檢測分化過程中miR-128和Nkx2-5的表達，探討miR-128對Nkx2-5基因表達的調控作用。

1　材料與方法

1.1材料4～6周齡SD大鼠，購于中國醫科大學實驗動物部，體質量80～120 g。LG-DMEM培養基、胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶購于Hyclone公司，5-氮雜胞苷購自Sigma公司，兔抗大鼠多克隆cTnI和Nkx2-5抗體購自Santa Cruz公司，小鼠胚胎成纖維細胞NIH3T3細胞系購于中國醫學科學院基礎醫學研究所。

1.2心肌樣細胞的誘導將大鼠脫頸處死，取出股骨和脛骨，反復沖出骨髓，接種到25 cm2培養瓶內; 于37℃、5% CO2培養箱中培養，每3～4d換液1次，待細胞達到80%融合后，用0.25%胰酶消化，收集細胞傳代。取第3代細胞做誘導，培養基中加入10 μmol/L的5-氮雜胞苷培養24 h后，更換完全培養基培養3周;倒置顯微鏡下觀察，顯示BMSCs均勻分布，呈梭形，誘導后細胞變細長，形態規則，平行排列。采用免疫熒光法檢測cTnI和Nkx2-5蛋白的表達，光鏡下顯示細胞內cTnI呈綠色熒光，Nkx2-5蛋白呈紅色熒光，二者均呈高表達。提示BMSCs向心肌樣細胞轉化。

1.3miR-128、Nkx2-5表達檢測采用Real-time PCR方法。取誘導6、10、14、18、22d的細胞，分別加入RNAiso for small RNA(TaKaRa)和RNAiso Plus提取總miRNA和總RNA;用RNase-free水稀釋為1 μg/μL，按照TaKaRa反轉錄試劑盒說明進行反轉錄;得到的cDNA樣品稀釋4倍，加入SYBRPremix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa)和miR-122檢測引物或Nkx2-5檢測引物;以U6或GAPDH為內參基因，在實時定量PCR儀上進行40個循環的PCR反應，應用軟件對反應結果進行定量分析。

1.4miR-128與Nkx2-5的靶向關系預測采用靶基因預測軟件miRanda(http: / /www.microrna.org/)和TargetScan(http: / /www.targetscan.org/)對miR-128和Nkx2-5基因(NM_053651)的靶向匹配關系進行預測，結果表明miR-128與Nkx2-5mRNA的3' UTR結合情況良好。

1.5miR-128與Nkx2-5的靶向關系鑒定

1.5.1 Nkx2-5 3'UTR的克隆取誘導培養22d的心肌樣細胞，加入RNAiso Plus提取總RNA;反轉錄為cDNA，利用正向引物5'-CCGAGCTCCCAGGAGAAGGGCGAGA-3'和反向引物5'-GCTCTAGAGGTCCTGTTGGGTCCGT-3'擴增Nkx2-5mRNA 3'UTR片段;瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，克隆到pMD 18-T(TaKaRa)載體上測序。

1.5.2Nkx2-5 3'UTR-pmirGLO的構建分別用SacⅠ和XbaⅠ雙酶切pmirGLO質粒載體以及Nkx2-5 3'UTR，參照TaKaRadNA連接試劑盒說明書，將Nkx2-5 3'UTR酶切片段與pmirGLO載體酶切片段相連;構建Nkx2-5 3'UTR-pmirGLO熒光素酶報告載體，轉化入DH5α感受態細胞中克隆擴增;按照AxyPrep質粒DNA小量試劑盒(Axygen)說明書從菌液中提取重組質粒，測序鑒定。

1.5.3雙熒光素酶檢測取NIH3T3細胞，加入含10% FBS的DMEM培養基中。轉染前1d，胰酶消化細胞并計數，細胞鋪板，使其在轉染日融合為90%～95%。對于每孔細胞，利用Lipofectamine 2000(Invitrogen)轉染Nkx2-5 3' UTR-pmirGLO 200 ng以及miR-128模擬物或對照miRNA 30 nmol/L;轉染24 h后，按照Promega公司Dual-Luciferase報告基因檢測系統檢測兩組熒光強度。

1.6統計學方法應用SPSS13.0統計軟件。結果以珋x±s表示，比較采用t檢驗;相關性分析采用Pearson直線相關。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1miR-128、Nkx2-5表達將誘導6d的Nkx2-5 和miR-128的表達量分別設為1，誘導10d的Nkx2-5表達量為4.33±1.32、22d為14.78±6.05，誘導10d的miR-128表達量為0.776 2±0.054 3、22d 為0.197 6±0.083 6。相關性分析顯示，二者呈負相關(r =－0.546，P =0.021)。

2.2miR-128對Nkx2-5表達的調控作用雙熒光素酶檢測結果顯示，相對于對照miRNA(設定其熒光素酶活性為1)，miR-128能使Nkx2-5 3' UTR-pmirGLO的熒光素酶表達下降為0.435 4± 0.072 6。

3　討論

NK-2基因主要編碼轉錄激活因子，能夠結合目的基因啟動子的共有序列［T(C/T)AAGTG］，從而激活轉錄。Nkx2-5基因是NK型同源盒基因家族成

員之一，其蛋白產物為心肌前體細胞早期標志物，在心肌細胞分化前就已經表達，于分化過程中高表達，是心肌細胞分化過程中的重要轉錄因子［4～6］。Lyons等［7］研究發現，敲除Nkx2-5基因的小鼠心臟發育出現異常。Schott等［8］發現，先天性心臟病患者中Nkx2-5基因發生突變，其類型主要是無義突變、RNA剪接信號突變以及閱讀框架異位突變等。雖然發育階段的脾、胃和甲狀腺組織有少量Nkx2-5蛋白表達，但出生后其表達水平顯著降低，而心肌中有顯著的特異性表達。表明Nkx2-5蛋白對多種器官發育有影響，但主要以對心肌的發育和分化作用為主［9］。本研究應用5-氮雜胞苷將大鼠BMSCs誘導為心肌樣細胞，免疫熒光化學檢測發現誘導后細胞內有cTnI和Nkx2-5蛋白表達。

miRNA廣泛參與生命活動過程中的基因表達調控［10～13］，其中miR-128參與了細胞分化以及癌癥發生等過程中基因表達的調控。Shi等［14］研究發現，miR-128能夠靶向作用于成肌細胞分化過程中的重要轉錄因子肌生成抑制蛋白，過表達miR-128能夠抑制小鼠成肌細胞系C2C12的增殖，卻促進其分化為肌細胞。Huang等［15］應用Real-time PCR檢測肝細胞癌組織中miR-128的表達，發現其較癌旁正常組織顯著降低，進一步在肝癌細胞系中發現miR-128能夠靶向調控PI3KR1的表達，激活PI3K/ AKT信號轉導通路，抑制癌細胞的增殖，推測其或可作為診斷肝細胞癌的標志物。

本次研究運用靶基因預測軟件miRanda和TargetScan對miR-128和Nkx2-5基因的靶向匹配關系進行預測，發現二者匹配關系良好。隨后通過雙熒光素酶報告系統研究發現，miR-128能夠靶向作用于Nkx2-5 3'UTR并抑制其表達。Real-time PCR結果表明隨著誘導時間延長，miR-128表達量逐漸降低，與Nkx2-5表達量呈負相關，提示miR-128參與了心肌樣細胞的誘導分化過程。

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收稿日期:( 2015-05-11)

作者簡介:第一朱國偉(1971-)，男，副主任醫師。研究方向為心臟的介入治療。E-mail: suifeng800sd@163.com

文章編號:1002-266X(2015)34-0001-03

文獻標志碼:A

中圖分類號:R33

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.34.001