腦膠質瘤組織中MRP、MGMT蛋白、P-gp的表達觀察

李劍，王建禎

(1濟源市人民醫院，河南濟源 459000；2北京武警總醫院)

?

腦膠質瘤組織中MRP、MGMT蛋白、P-gp的表達觀察

李劍1，王建禎2

(1濟源市人民醫院，河南濟源 459000；2北京武警總醫院)

摘要：目的觀察腦膠質瘤組織中多藥耐藥相關蛋白(MRP)、六氧甲基鳥嘌呤DNA甲基轉移酶(MGMT)蛋白、P糖蛋白(P-gp)的表達情況。方法腦膠質瘤組織64例份(觀察組)，正常腦組織12例份(對照組)，采用免疫組織化學SP法檢測兩組腦組織中的MRP、MGMT蛋白和P-gp。結果觀察組MRP、MGMT蛋白、P-gp陽性率分別為78.1%、67.2%、42.2%，對照組分別為8.3%、8.3%、0，兩組比較，P均<0.05。觀察組不同性別、不同年齡(<40歲，≥40歲)MRP、MGMT蛋白、P-gp陽性率比較差異無統計學意義。觀察組中MRP與MGMT蛋白、MGMT蛋白與P-gp、P-gp與MRP表達無相關性。結論 腦膠質瘤組織中MRP、MGMT蛋白和P-gp高表達。

關鍵詞：腦腫瘤；膠質瘤；多藥耐藥相關蛋白；嘌呤-DNA-甲基轉移酶；P糖蛋白

腦膠質瘤在顱內腫瘤中發病率最高，且術后易復發，嚴重影響了膠質瘤的手術療效。術后化療在腦膠質瘤的綜合治療中起積極作用，但腦膠質瘤對大多數化療藥物不敏感。近年來分子生物學研究發現，膠質瘤細胞內某些耐藥基因及其產物的表達是出現耐藥的重要機制。與其相關的基因有多藥耐藥相關蛋白(MRP)基因、六氧甲基鳥嘌呤DNA甲基轉移酶(MGMT)、多藥耐藥基因等，它們的表達產物MRP、MGMT蛋白、P糖蛋白(P-gp)可分別通過各自不同的分子生物學機制導致膠質瘤細胞對不同的化療藥物產生耐藥[1～4]。本研究采用免疫組化法檢測了64例人腦膠質瘤中的MRP、MGMT蛋白、P-gp，旨在為人腦膠質瘤的化療提供新的思路與方法。

1材料與方法

1.1標本來源選擇2010年3月～2011年8月北京武警總醫院神經腫瘤外科手術切除的腦膠質瘤組織64例份(觀察組)，所有患者均為初發病例并經病理明確診斷，其中男40例、女24例，年齡20～72歲。依據WHO神經系統腫瘤分類與分級標準(2000)分類，Ⅲ級42例、Ⅳ級22例。另選擇正常腦組織12例份(對照組)，為同期顱腦外傷術中切除的腦組織和同期因腦動靜脈畸形而行手術治療患者為顯露病灶而切除的正常腦組織，這些腦組織均經病理學檢查證實。

1．2主要試劑MRP小鼠抗人單克隆抗體、MGMT小鼠抗人單克隆抗體、P-gp小鼠抗人單克隆抗體、SP-9002免疫組化試劑盒、液體DAB酶底物顯色試劑盒購自北京山生物技術公司；PBS緩沖液、4%中性甲醛溶液由北京武警總醫院病理實驗室配制;70%、90%、95%、100%乙醇,二甲苯購自北京化工廠。

1．3MRP、MGMT蛋白、P-gp檢測 采用免疫組織化學染色法。將兩組腦組織石蠟包埋，4 μm厚連續切片，按照常規SP法檢測MRP、MGMT蛋白和P-gp。結果判定：腦組織細胞質或細胞核內有棕黃色顆粒為MGMT蛋白陽性；細胞質或細胞膜內有棕黃色顆粒為MRP、P-gp陽性。在高倍鏡(200×)下對每張切片隨機選取5個視野，計數視野中陽性細胞數<10%為陰性，10%～30%為+，≥30%為++，+、++視為陽性。

1．4統計學方法采用SPSS17.0統計軟件。計數資料比較用χ2檢驗，兩變量間的相關性檢驗采用Spearman相關分析法。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

觀察組MRP、MGMT蛋白、P-gp陽性率分別為78.1%、67.2%、42.2%，對照組分別為8.3%、8.3%、0，兩組比較，P均<0.05。觀察組中不同性別(男、女)MRP陽性率分別為80.0%、75.0%，MGMT蛋白陽性率分別為70.0%、62.5%，P-gp陽性率分別為45.0%、37.5%；不同年齡(<40歲、≥40歲)MRP陽性率分別為71.4%、81.4%，MGMT蛋白陽性率分別為61.9%、69.8%，P-gp陽性率分別為33.3%、46.5%；不同性別、年齡各蛋白陽性率比較差異無統計學意義。觀察組中MRP與MGMT蛋白表達無相關性(r=-0.0696，P=0.5849)，MGMT蛋白與P-gp表達無相關性(r=-0.0905，P=0.4768)，P-gp與MRP蛋白表達無相關性(r=-0.0708，P=0.5784)。

3討論

化療為人腦膠質瘤綜合治療體系中的重要治療手段之一，然而臨床化療的效果并不理想，膠質瘤對化療藥物的耐藥性是影響化療效果的主要因素。腦膠質瘤化療耐藥是由多種因素共同作用引起的，其可能存在的因素有：血腦屏障的存在導致藥物難以到達腫瘤細胞；藥物在腦膠質瘤細胞的積聚減少；DNA損傷的修復；化療藥物的解毒代謝加快等。近年來，許多學者試圖從分子水平闡明人腦膠質瘤化療耐藥發生的機制。

MRP既是一種能量泵，同時也是一種谷胱甘肽偶合泵，可介導化療藥物中的葡萄糖醛酸甙共軛物、谷胱甘肽硫共軛物和硫酸鹽共軛物排出細胞，從而導致耐藥的產生。MRP不但定位于細胞膜，而且還存在于高爾基濾泡、內質網等處，可參與細胞質內囊泡的運輸，引起藥物亞細胞分布的改變，在細胞內隔離化療藥物，使化療藥物不能與其靶位點結合，從而間接導致耐藥[5,6]。本研究結果表明，MRP在膠質瘤組織中的表達較正常腦組織高，且與性別、年齡無關。MRP主要對天然植物類抗腫瘤藥、烷化劑、鉑類耐藥。MGMT是一種相對分子質量為22 kDa的普遍存在的DNA修復酶，可保護染色體免受烷化劑的損傷。MGMT在星形膠質瘤細胞內的含量最高，在小膠質細胞及少突膠質細胞內含量極低，在各類顱內腫瘤中的含量也不相同。MGMT可通過修復被亞硝脲類化療藥物烷基化的鳥嘌呤從而阻止DNA交鏈的形成，降低此類化療藥物的細胞毒作用[7]，因此，MGMT基因及其產物的表達與亞硝脲類化療藥物的耐藥密切相關[8,9]，提示MGMT表達陽性的腦膠質瘤患者不宜用替莫唑胺(TMZ)等亞硝脲類化療藥物治療。孫彥輝等[10]報道，MGMT陰性表達的腦膠質瘤患者的生存期明顯高于陽性表達的患者，所以MGMT還可以作為判斷人腦膠質瘤預后的一個指標。本研究結果表明，MGMT蛋白在膠質瘤組織中的表達較正常腦組織高，且與性別、年齡無關。P-gp介導的多藥耐藥是研究最廣泛、最深入的耐藥途徑。P-gp是一種能量依賴性藥物輸出泵，它既具有與一些抗腫瘤藥物結合的部位，又具有ATP結合位點，故P-gp一旦與某些抗腫瘤藥物結合，就能通過ATP提供能量，將抗腫瘤藥物泵出腫瘤細胞，進而產生耐藥現象。P-gp高表達的膠質瘤患者預后常不良，可作為判斷預后的粗略指標。方勝等[11]用免疫組化法檢測發現63例腦膠質瘤組織中P-gp的陽性表達率為39.68%，化療后較化療前的陽性率明顯升高。本研究結果顯示，人腦膠質瘤中P-gp的陽性表達率為42.2%，高于正常腦組織。許多學者的研究均證實，P-gp的陽性表達水平與腦膠質瘤對化療藥物的敏感性呈明顯的負相關。P-gp主要導致膠質瘤細胞對細胞毒類化療藥物、抗生素類化療藥物及激素類化療藥物耐藥。

總之，腦膠質瘤的耐藥機制非常復雜，MRP、MGMT蛋白、P-gp在人腦膠質瘤組織均有較高表達，他們分別通過不同的耐藥機制導致腦膠質瘤對化療藥物產生耐藥，故聯合檢測它們在人腦膠質瘤組織中的表達情況可指導臨床醫生為每位腦膠質瘤患者制定合理的個體化化療方案。

參考文獻：

[1] McClean S, Hill BT. An overview of membrane, cytosolic and nuclear proteins associated with the expression of resistance to multipledrugs in vitro[J]. Biochim Biophys Acta, 1992,1114(2-3):107-127.

[2] Jirsch J, Deeley RG, Cole SP, et al. Inwardly rectifying K+channels and volume-regulated anion channels in multidrug-resistant small cell lungcancer cells[J]. Cancer Res, 1993,53(18):4156-4160.

[3] Rittierodt M, Harada K. Repetitive doxorubicin treatment of glioblastoma enhances the PGP expression--a special role for endothelial cells[J]. Exp Toxicol Pathol, 2003,55(1):39-44.

[4] Haga S, Hinoshita E, Ikezaki K, et al. Involvement of the multidrug resistance protein 3 in drug sensitivity and its expression in human glioma[J]. Jpn J Cancer Res, 2001,92(2):211-219.

[5] Lautier D, Canitrot Y, Deeley RG, et al. Multidrug resistance mediated by the multidrug resistance protein (MRP) gene[J]. Biochem Pharmacol, 1996,52(7):967-977.

[6] Chamberlain MC. Treatment options for glioblastoma[J]. Neurosurg Focus, 2006,20(4):E19.

[7] Alonso ME, Bello MJ, Gonzalez-Gomez P, et al. Aberrant promoter methylation of multiple genes in oligodendrogliomas and ependymomas[J]. Cancer Genet Cytogenet, 2003,144(2):134-142.

[8] Mineura K, Izumi I, Watanabe K, et al. Influence of O6-methylguanine-DNA methyltransferase activity on chloroethylnitrosourea chemotherapy in brain tumors[J]. Int J Cancer, 1993,55(1):76-81.

[9] Kanzawa T, Germano IM, Kondo Y， et al. Inhibition of telomerase activity in malignant glioma cells correlates with their sensitivity to temozolomide[J]. Br J Cancer, 2003,89(5):922-929.

[10] 孫彥輝，張亞卓，王忠誠，等.MGMT在腦膠質瘤組織中的表達及其與患者生存期的關系[J].癌癥，2004,23(9):1052-1055.

[11] 方勝，袁先厚，裴永恩，等.P-gp、bcl-2和bax蛋白在人腦膠質瘤中的表達[J].腫瘤防治研究，2003，30(1):72.

收稿日期：(2015-05-14)

中圖分類號：R739.41

文獻標志碼：B

文章編號：1002-266X(2015)47-0062-02

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.47.024