TRAF2基因轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖情況觀察

張曉麗，溫志鋒，米小軼( 沈陽(yáng)市婦嬰醫(yī)院生殖中心，沈陽(yáng)000;中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院)

TRAF2基因轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖情況觀察

張曉麗1，溫志鋒2，米小軼2
( 1沈陽(yáng)市婦嬰醫(yī)院生殖中心，沈陽(yáng)110001;2中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院)

摘要:目的觀察TRAF2基因轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖情況。方法轉(zhuǎn)染hTRAF2pLPCX-HA-Flag/P874質(zhì)粒于MCF-7細(xì)胞，以空質(zhì)粒pcDNA3作為陰性對(duì)照。MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞中NF-κB的核表達(dá)。結(jié)果轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒、轉(zhuǎn)染hTRAF2pLPCX-HA-Flag/P874質(zhì)粒的MCF-7細(xì)胞48 h的吸光度值分別為0.313±0.019、0.606±0.007，72 h分別為0.708±0.193、1.332±0.075，96 h分別為0.936±0.203、1.462± 0.231，兩者比較，P均＜0.001。轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒、轉(zhuǎn)染hTRAF2pLPCX-HA-Flag/P874質(zhì)粒的MCF-7細(xì)胞NF-κB的核表達(dá)分別為0.789±0.236、1.169±0.369，兩者比較，P＜0.01。結(jié)論TRAF2基因轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖能力增強(qiáng)。

關(guān)鍵詞:乳腺腫瘤;腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2;核轉(zhuǎn)錄因子κB;細(xì)胞增殖

腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子( TRAF)是一類重要的胞質(zhì)銜接蛋白，它能夠與腫瘤壞死因子受體( TNFR)超家族成員等多種細(xì)胞表面受體的胞質(zhì)部分結(jié)合，從而調(diào)節(jié)正常以及腫瘤細(xì)胞的增殖、存活、凋亡。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)7種TRAF家族成員( TRAF1 ～7)，其中TRAF2是這一信號(hào)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的中心環(huán)節(jié)。TRAF2接受TNF-α的刺激后，可以調(diào)節(jié)JNK-c-JUN、Iκκ/NF-κB信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活［1］。且TRAF2可以與TRAF1、TRAF3、TRAF4及TRAF6相互結(jié)合［2～5］。但有關(guān)TRAF2在腫瘤中的具體作用機(jī)制還不十分清楚，因此本研究觀察了TRAF2基因轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖情況。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)人正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A、人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心。MCF-10A用DMEM/F12( 1∶1)培養(yǎng)基培養(yǎng)，并添加5%馬血清、10 μg/mL胰島素及20 ng/mL表皮生長(zhǎng)因子。MCF-7用添加10%標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清及100 U青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。所有上述細(xì)胞均在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 MCF-7細(xì)胞TRAF2基因轉(zhuǎn)染方法hTRAF2pLPCX-HA-Flag/P874序列購(gòu)自Addgene公司(美國(guó))。Attractene質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Qiagen公司(德國(guó))。根據(jù)制造商說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。空質(zhì)粒pcDNA3作為陰性對(duì)照。

1.3 TRAF2、NF-κB蛋白檢測(cè)采用Western blotting法檢測(cè)MCF-10A及MCF-7中的TRAF2及NF-κB蛋白。采用美國(guó)Pirece公司的NE-PER核質(zhì)蛋白抽提試劑盒，根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行抽提細(xì)胞核蛋白。檢測(cè)轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒、轉(zhuǎn)染hTRAF2pLPCX-HA-Flag/P874質(zhì)粒后MCF-7細(xì)胞中NF-κB的核表達(dá)。細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS清洗3次，加入適量細(xì)胞裂解液，提取總蛋白。加樣，上樣蛋白量為50 μg。聚丙烯酰胺瓊脂糖凝膠電泳，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜后，室溫下5%正常小牛血清封閉2 h，將膜放在含相應(yīng)一抗的封閉液中［抗TRAF2( 1∶1 000)、NF-κB( 1∶500)、βactin( 1∶1 000)、Lamin B1( 1∶500)］，4℃孵育過(guò)夜，與相應(yīng)二抗室溫孵育2 h，膜取出后加入ECL顯色液。自動(dòng)電泳凝膠成像分析儀采集結(jié)果，進(jìn)行灰度值測(cè)定。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上，取平均值。

1.4 TRAF2基因轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞增殖情況采用MTT法。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒或hTRAF2pLPCX-HA-Flag/P874質(zhì)粒。MCF-7細(xì)胞用0.25%的胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液(細(xì)胞密度3×105個(gè)/mL)，分別接種于4個(gè)96孔板培養(yǎng)板，細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72、96 h后分別加入MTT( 5 mg/mL) 20 μL，繼續(xù)孵育4 h后，每孔加入150 mL DMSO溶解結(jié)晶，選擇波長(zhǎng)550 nm，在酶聯(lián)免疫( ELISA)檢測(cè)儀上測(cè)定各孔吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，結(jié)果取平均值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以珋x±s表示，組間比較用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

MCF-10A、MCF-7細(xì)胞系中TRAF4蛋白表達(dá)分別為0.385±0.123、0.723±0.223，兩者比較，P＜0.01。轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒、轉(zhuǎn)染hTRAF2pLPCX-HA-Flag/P874質(zhì)粒的MCF-7細(xì)胞，48 h的吸光度值分別為0.313±0.019、0.606±0.007，72 h分別為0.708± 0.193、1.332±0.075，96 h分別為0.936±0.203、1.462±0.231，兩者比較，P均＜0.01。轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒、轉(zhuǎn)染hTRAF2pLPCX-HA-Flag/P874質(zhì)粒的MCF-7細(xì)胞NF-κB的核表達(dá)分別為0.789±0.236、1.169±0.369，兩者比較，P＜0.01。

3　討論

TNF誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用是通過(guò)許多信號(hào)分子共同參與完成的一個(gè)網(wǎng)絡(luò)工程，其中TRAFs家族蛋白，尤其是TRAF2，是這一信號(hào)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的中心環(huán)節(jié)。TRAF2在接受TNF-α的刺激后，可以調(diào)節(jié)JNK-c-JUN以及Iκκ/NF-κB信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活。最近報(bào)道指出，由凋亡抑制因子( cIAP1及cIAP2)、TRAF2、TRAF3、JNK組成的復(fù)合物在非經(jīng)典NF-κB激活中起重要作用。TRAF2募集cIAP1及cIAP2，激活cIAPs，并激活K63相關(guān)泛素化作用［6～8］。基因敲除實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TRAF2可以抑制TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。另一方面，氧化應(yīng)激所導(dǎo)致的TRAF2磷酸化能顯著促進(jìn)由于Iκκ激活延長(zhǎng)以及JNK激活時(shí)期縮短所導(dǎo)致的細(xì)胞存活［9～12］。

本研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細(xì)胞MCF-7中的TRAF2表達(dá)高于正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A，表明TRAF2可能與乳腺癌細(xì)胞的增殖有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，TRAF2基因轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞MCF-7后可顯著增強(qiáng)細(xì)胞NF-κB的核轉(zhuǎn)位，并且明顯促進(jìn)該細(xì)胞的增殖能力。TRAF2在胰腺癌細(xì)胞系中可與CD40相結(jié)合，并能促進(jìn)JNK的激活和NF-κB報(bào)告基因的活化［13］。推測(cè)TRAF2在MCF-7細(xì)胞中可能通過(guò)某種方式激活NF-κB的核轉(zhuǎn)位從而促進(jìn)該細(xì)胞的增殖。

綜上可見(jiàn)，TRAF2在乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，TRAF2基因轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖能力增強(qiáng)。這可能是由于TRAF2可通過(guò)激活NF-κB的核轉(zhuǎn)位促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖，其具體的作用機(jī)制以及其中是否還有其他TRAF家族成員的參與還需要我們進(jìn)一步探討。

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收稿日期:( 2015-05-09)

文章編號(hào):1002-266X( 2015) 31-0023-02

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號(hào):R737.9

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.31.008