肺癌細胞株A549、H1650、DMS53中整合素α3的表達比較

張帆，唐妮娜，劉慧琳，郭琳瑯(南方醫科大學珠江醫院，廣州510282)

肺癌細胞株A549、H1650、DMS53中整合素α3的表達比較

張帆，唐妮娜，劉慧琳，郭琳瑯
(南方醫科大學珠江醫院，廣州510282)

摘要:目的比較整合素α3( ITGA3)在三種肺癌細胞株A549(肺腺癌)、H1650(肺泡細胞癌)、DMS53(小細胞肺癌)中的表達。方法應用基因芯片技術提取A549、H1650、DMS53細胞株的mRNA，反轉錄為cDNA，以32P標記cDNA，與整合素基因芯片進行雜交，經放射自顯影后讀取灰度值，并以基因表達的限制性分析( RAGE)和流式細胞儀技術進行驗證。結果ITGA3亞單位在A549、H1650、DMS53細胞株中的表達分別為7.58±1.37、8.10± 1.51、2.38±0.20，A549、H1650與DMS53細胞株比較，P均＜0.01。RAGE結果顯示，經AvaⅡ酶切后，A549、H1650、DMS53細胞株均出現ITGA3( 69 bp)，分別為167.0、172.1、44.7，A549、H1650與DMS53細胞株比較，P均＜0.01。流式細胞儀檢測結果顯示，ITGA3在A549、H1650、DMS53細胞株中的表達分別為83.62±1.40、90.86± 4.78、1.24±0.53，A549、H1650與DMS53細胞株比較，P均＜0.01。結論ITGA3在A549和H1650細胞株中的表達上調，高于其在DMS53細胞株中的表達。

關鍵詞:肺腫瘤;肺癌細胞;整合素α3

肺癌是全球常見的惡性腫瘤之一。隨著工業化的發展及空氣和環境污染的加劇，肺癌發病率逐漸增加，世界衛生組織估計，肺癌在全球的增長速度為每年0.5%，初治病例約70%是晚期患者［1］。肺癌的惡性程度與腫瘤的類型、級別相關。瘤細胞轉移的早晚是腫瘤惡性程度的標志，而腫瘤的轉移是一個極其復雜的過程，參與腫瘤轉移調控的相關基因多達數百種。DNA修復基因、抑癌基因、抗凋亡基因、整合素等的多態性與個體對肺癌細胞的易感性有關［2～5］，其中整合素在調控腫瘤轉移過程中起重要作用。隨著腫瘤分子生物學研究技術的發展，越來越多的調控腫瘤轉移和凋亡分子被發現，其中整合素在肺癌發生、發展、轉移及凋亡各個步驟中所起的作用逐漸被認識。本研究應用基因芯片技術、基因表達的限制性分析( RAGE)和流式細胞儀檢測并比較了三種不同類型的肺癌細胞株中整合素α3 ( ITGA3)的表達差異。

1　材料與方法

1.1細胞及試劑本實驗所用A549(肺腺癌)、H1650(肺泡細胞癌)、DMS53(小細胞肺癌)細胞株購自The American Type Culture Collection( ATCC) ;所用基因芯片為細胞外基質和黏附分子分類芯片( SuperArray Inc.Bethesda，MD，USA) ;鼠抗人α3單克隆抗體購自美國Chemicon公司; FITC標記羊抗鼠IgG購自美國One Lambda公司; HexaLabelTMDNA Labeling Kit購自上海前塵生物科技有限公司。

1.2三種肺癌細胞株中ITGA3檢測方法取凍存的A549、H1650、DMS53細胞株37℃融化后，1 000 r/min離心10 min，用含有10%胎牛血清( Hyclone公司)的低糖DMEM培養液(美國Invitrogen公司)懸浮，移入培養瓶中。培養液中加入青鏈雙抗液，使終濃度為100 μg/mL，置于37℃、5% CO2的培養箱中培養，3 d換液1次。提取三種細胞株中的總RNA，濃縮、純化，逆轉錄合成并以32P ( 10 Ci/L)標記cDNA，與基因芯片進行雜交，經放射自顯影，可出現強弱不同的雜交點，以成像系統讀取數值，并以軟件ScanAlyze2和GEArrayAnalyzer分析。從基因庫獲取ITGA3亞單位的cDNA序列，采用MacVector公司ClustalW軟件設計引物序列，進行PCR擴增，然后將ITGA3亞單位的PCR擴增產物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用分子圖像FX成像器掃描凝膠，并用Bio-Rad軟件分析。將1×106的培養細胞用2.5 g/L胰蛋白酶消化，PBS洗滌3次，50 mg/mL多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌破膜裂解細胞，用2 μg/mL的鼠抗人α3單克隆抗體孵育1 h，

800 r/min離心5 min，棄上清，PBS清洗2遍后，加入FITC標記羊抗鼠IgG抗體，稀釋濃度為1∶50，孵育30 min。用流式細胞儀分析細胞的熒光水平。重復以上操作3次，取平均值。

1.3統計學方法采用SPSS13.0統計軟件。計量資料以珋x±s表示，組間比較用one-way ANOVA，兩兩比較用LSD檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

ITGA3亞單位在A549、H1650、DMS53細胞株中的表達分別為7.58±1.37、8.10±1.51、2.38± 0.20，A549、H1650與DMS53細胞株比較，P均＜0.01，A549與H1650細胞株比較無統計學差異。

RAGE結果顯示，經AvaⅡ酶切后，A549、H1650、DMS53細胞株均出現ITGA3( 69 bp)，分別為167.0、172.1、44.7，A549、H1650與DMS53細胞株比較，P均＜0.01，A549與H1650細胞株比較無統計學差異。流式細胞儀檢測結果顯示，ITGA3在A549、H1650、DMS53細胞株中的表達分別為83.62 ±1.40、90.86±4.78、1.24±0.53，A549、H1650與DMS53細胞株比較，P均＜0.01，A549與H1650細胞株比較無統計學差異。

3　討論

整合素是位于細胞表面的異二聚體，是連接細胞骨架及細胞外基質的細胞表面受體，其胞內部分(＜70個殘基)連接細胞內骨架，較大的胞膜外區域(＞700個殘基)與配體結合，以建立細胞內外的聯系［6］。整合素通過識別細胞外基質中配體蛋白的特殊序列與配體結合，其中RGD序列是最經典的識別序列。靠近RGD多肽結合位點的氨基酸殘基決定了整合素-配體結合特異性及親和力［7］。目前確認的18種α亞單位和8種β亞單位共同組成至少24種整合素［8］。整合素在正常組織和瘤組織中的表達是不同的，研究人類腫瘤細胞整合素表達與腫瘤類型、級別及病理結果的相關性，可識別整合素在腫瘤的發生及發展過程中的作用。整合素不僅介導細胞與細胞、細胞與細胞外基質的黏附反應，還具有細胞內外信號傳導功能［9，10］，整合素可通過傳遞特定的信號或誘導基因表達來調控腫瘤的轉化、生長、侵襲、轉移及凋亡［11，12］。整合素的過度表達、缺失或磷酸化影響細胞骨架與細胞外配體的特異結合，整合素表達的變化在腫瘤的發生或抑制過程中起重要作用。大量的研究表明，整合素在惡性腫瘤和同型的癌前病變之間的表達和分布有著顯著的差異。整合素表達上調并非總是與腫瘤的發生及轉移呈正相關，不同整合素對不同類型腫瘤的形成及轉移作用不同。同一整合素在不同腫瘤中的作用也不盡相同。

本研究的整合素家族基因芯片分析結果顯示，ITGA3在A549和H1650細胞株中的表達高于其在DMS53細胞株中的表達。且這一結果在RAGE和流式細胞儀檢測中得到驗證。ITGA3在肺組織的生長發育過程中起重要作用，ITGA3在非小細胞肺癌細胞H1650和A549的表達上調，ITGA3表達下調可使非小細胞肺癌中具有致瘤性的c-myc的表達增強，因而為腫瘤的生長、侵襲和轉移創造了條件［13］，ITGA3表達下調同時也預示著肺腺癌患者的預后不良。ITGA3表達的降低與某些惡性腫瘤的發生或其他腫瘤的侵入密切相關［14］，在小細胞肺癌細胞DMS53中，ITGA3的表達下調，這為小細胞肺癌的發生和早期轉移提供了物質基礎。

總之，三種不同類型的肺癌細胞株中ITGA3表達存在差異，這種表達差異性一方面可作為鑒別小細胞肺癌和非小細胞肺癌的標志物，同時還有望成為肺癌基因治療新的靶點。

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收稿日期:( 2015-05-11)

通信作者:郭琳瑯

基金項目:廣東省省級科技計劃項目( 2013B021500146)。

文章編號:1002-266X( 2015)31-0025-03

文獻標志碼:A

中圖分類號:R734.2

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.31.009