人包皮成纖維細胞支持生長的人胚胎干細胞小鼠體內分化全能性觀察

摘要:目的　觀察用人包皮成纖維細胞(hPFF)支持生長的人胚胎干細胞(hESC)的體內全能性。方法　將第20代hPFF支持生長的hESC和hPFF分別接種到2只嚴重聯合免疫缺陷的小鼠(SCID)小鼠體內，分別為觀察組和對照組，觀察5周內兩組小鼠一般狀態及是否有畸胎瘤形成。取觀察組小鼠畸胎瘤制作組織學切片，驗證其是否包含了源于全部3個胚層的各種分化細胞。結果　觀察組SCID小鼠接種后第5天即可在接種部位觸到包塊，包塊進行性增大。觀察組小鼠包塊理組織學檢查顯示，該腫塊包含3個胚層的組織結構，具備畸胎瘤的病理組織學特點。結論　用hPFF支持生長的hESC有體內分化全能性。

doi: 10．3969/j．issn．1002-266X．2015．38．008

文獻標志碼: A

文章編號: 1002-266X(2015)38-0024-03

Totipotency analysis of human embryonic stem cells supported by human postnatal foreskin fibroblasts in mice

MI Qiang 1，HE Zhi-xu

(1 Shanghai Children＇s Medical Center Affiliated to Shanghai Jiaotong

University School of Medicine，Shanghai 200271，China)

Abstract: Objective To observe the totipotency analysis of human embryonic stem cells (hESCs)supported by human postnatal foreskin fibroblasts (hPFFs)．Methods The hESCs of the 20th passage supported by hPFF and hPFF were respectively injected into the hind legs of the severe combined immunode? cient mice (SCID)and taken as the observation and control group．After 5-week，we observe the general state and teratoma formation of the two mice．The teratoma was taken from the observation group for the histological analysis to investigate whether there were different kinds of differentiated cells derived from three germ layers．Results We touched the masses in the vaccination site of SCID mice on the fifth day after inoculation，and the masses increased progressively．Five weeks later，we killed the mice to strip the tumor，and then they received the histologic examination．It showed that the mass contained three germ layers＇structures with the histologic characteristics of teratoma．Conclusions The hESCs supported by hPFFs have totipotency．

Key words: embryonic stem cells; fibroblasts; feeder layer; human; teratoma; mice

基金項目:上海青年醫師培養資助計劃項目(EY21．001)。

通信作者:何志旭

1998年，Thomson等 ［1］將人受精卵在體外培養成囊胚，分離囊胚內細胞團細胞，利用小鼠胚胎成纖維細胞(mEFs)作為培養人胚胎干細胞(hESC)的飼養層，建立了hESC系。這些細胞表達ESC所特有的一系列表面標記物，還可以在體外永久傳代，并保持正常核型，具有發育的全能性，能分化出成體動物的所有組織和器官，包括生殖細胞。如果把它們注射到免疫缺陷鼠的體內，可以形成畸胎瘤 ［2］。這些畸胎瘤包括了所有三個胚層來源的細胞類型，證明了hESC的亞全能分化特性。前期研究中我們用人包皮成纖維細胞(hPFF)作為飼養層培育hESC。2014年10～12月，我們用畸胎瘤形成實驗觀察hPFF支持生長的hESC體內分化全能性，驗證以hPFF為飼養層培養hESC的生物學能力。

1材料與方法

1．1材料　hPFF購自美國ATCC Manassas;人胚胎干細胞(HS181)由瑞典卡羅琳斯卡Huddinge附屬醫院臨床細胞和生殖中心Outi Hovatta教授提供。嚴重聯合免疫缺陷小鼠(SCID小鼠)購于丹麥的M＆B實驗動物公司。高糖DMEM培養基，Ⅰ型膠原酶，人白血病抑制因子(LIF)購自美國Gibco公司;胎牛血清購自美國Hyclon公司;谷氨酰胺購自美國Amresco公司;非必需氨基酸、β-巰基乙醇、丙酮酸鈉購自美國Sigma公司。

1．2體內全能性觀察方法 ［3］　采用畸胎瘤形成實驗。取在hPFF飼養層上連續傳代20代對數生長期的hESC，用PBS沖洗2次，將其制備成活細胞數為3×10 6～5×10 6/mL的細胞懸液;取0．5 mL細胞懸液接種于8～10周齡、體質量18～22 g的2只雄性SCID小鼠(觀察組)大腿內側皮下，以相同細胞密度的飼養層細胞hPFF注射到另外2只雄性SCID小鼠(對照組)，每周觀察并觸診畸胎瘤的生長情況。于接種第5周拉頸處死小鼠，摘取瘤體，測量腫瘤大小;并將其用4%中性甲醛過夜固定，石蠟包埋，切片后HE染色，行病理學檢查。

2　結果

接種第5天觀察組小鼠出現精神差、飲食不佳，接種部位可觸到一大米粒大小、柔軟的包塊;第2周小鼠精神萎靡，飲食差，皮毛光澤差，體質量下降，有舔大腿內側的舉動，接種處的皮膚隆起、質地變韌; 第5周小鼠精神極差，飲食更差，皮毛稀疏、干燥、無光澤，體質量明顯下降，后腿活動受限，接種部位可觸及一蠶豆大小堅韌的可活動的瘤體。

拉頸處死小鼠，剪開大腿內側皮膚，可見腫瘤樣結構，有包膜包裹，邊界清楚，與周圍組織無粘連，測量腫瘤大小為3．2 cm×4．2 cm×3．5 cm。解剖該腫瘤，其由囊腔和實性區組成，部分囊腔充滿膠凍樣物。進行病理組織學檢查顯示，該腫塊包含3個胚層的組織結構，鏡下見囊壁內表面有表皮被覆，除此還可見其他的外胚層結構，如上皮組織、神經纖維。同時還可見中胚層成份，如肌肉、軟骨、骨組織;也可見內胚層成份，如腸道腺體等。對照組小鼠未見異常。

3　討論

自1981年英國劍橋大學的Evans和Kaufman等用不同的方法成功地分離、建立了小鼠胚胎干細胞系以來，歷經將近20多年，第一株hESC系在美國威斯康星大學成功建立 ［4］。同年，另一研究小組 ［5］用流產胎兒性腺成功地分離和培養了hESC系。有人將二者統稱為胚胎干細胞系。這一成就使世界范圍內掀起了研究熱潮，相信hESC將會給移植治療、藥物篩選、細胞及基因治療和發育生物學的基礎研究等帶來深遠的影響，打開了體外生產所有類型的可供移植治療的人體細胞、組織乃至器官的大門 ［6～9］。

隨著hESC研究的進一步發展，其培養體系的進一步完善成為了研究的熱點 ［10～12］。既往常使用mEF作為hESC的飼養層，但mEF作為飼養層卻存在以下幾點不足:①存在異種蛋白抗原和攜帶致病微生物的威脅。②需要制備大量的mEF。因為mEF生存期有限，不能在體外長久使用，只限于第3～5代使用效果最佳 ［13］，且其產生促增殖因子和抑制分化因子的能力會隨著傳代時間的延長而減弱甚至喪失。③不易獲得純的ESC作為生化和分子生物學方面的分析。④死亡的mEF染色體釋放可能會引起ESC的突變及影響正常核型的保持，因而mEF細胞在目的基因轉移的ESC陽性克隆的篩選中受到限制。后來研究者們又進行了其他動物ESC的培養研究，發現不同種系的ESC對飼養層的要求不同，得出一個規律:不同動物的ESC最好用同源的細胞作為飼養層細胞，這樣可以避免異種蛋白污染。一切動物實驗最終都要用于hESC的培養，避免異種蛋白污染是將hESC應用于臨床研究前必須解決的問題。

ESC具有體內分化潛能表現。在將hESC懸液注射到動物皮下后，在動物體內能夠形成畸胎瘤。Thomson等 ［1］將自囊胚分離的5個hESC系分別注射到裸鼠體內，結果在每個裸鼠體內均產生了包含3個胚層組織的畸胎瘤，畸胎瘤中的組織包括胃上皮(內胚層)、軟骨、骨髓、平滑肌、橫紋肌(中胚層)和多層鱗片狀上皮(外胚層)。有的組織還具有發育良好的組織類型(如形成神經節)。我們將在hPFF上連續傳代到第20代hESC，分別接種到2只SCID小鼠的大腿內側皮下，接種后的第5日于接種部位均觸到一大米粒大小，柔軟的包塊，隨后包塊呈進行性增大。解剖該腫塊并進行病理組織學檢查顯示，該腫塊包含3個胚層的組織結構。鏡下見囊壁內表面有表皮被覆，除此還可見其他的外胚層結構，如上皮組織、神經纖維;同時還可見中胚層成分，如肌肉、軟骨、骨組織;也可見內胚層成分，如腸道腺體等，證實其是畸胎瘤。表明hPFF支持生長的hESC具有較好的體內分化全能性。