子癇前期患者胎盤及臍帶組織IDO、MIF表達(dá)變化及意義

張靜，楊再全，李霞，姚曉玲，田園，于彩霞

(1滄州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河北滄州061001；2滄州市傳染病醫(yī)院；3滄州市人民醫(yī)院)

子癇前期患者胎盤及臍帶組織IDO、MIF表達(dá)變化及意義

張靜1，楊再全2，李霞3，姚曉玲3，田園1，于彩霞1

(1滄州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河北滄州061001；2滄州市傳染病醫(yī)院；3滄州市人民醫(yī)院)

目的 觀察子癇前期(PE)患者胎盤及臍帶組織吲哚胺2，3-雙加氧酶(IDO)、巨噬細(xì)胞移動抑制因子(MIF)的表達(dá)變化，并探討其意義。方法 PE患者66例，其中輕度32例(輕度組)、重度34例(重度組)，同期健康晚孕婦女42例作為對照組。分別采用RT-PCR法和Western blot法檢測胎盤、臍帶組織中IDO、MIF mRNA和蛋白，用彩色超聲多普勒診斷儀檢測各組產(chǎn)前胎兒的臍動脈血流阻力指數(shù)(RI)，記錄新生兒體質(zhì)量。結(jié)果 重度組、輕度組、對照組胎盤、臍帶組織IDO mRNA及蛋白相對表達(dá)均逐漸升高，MIF mRNA及蛋白相對表達(dá)、RI均逐漸降低；組間兩兩比較，P均<0.01。重度組新生兒體質(zhì)量均低于輕度組和對照組，P均<0.01。PE患者中，胎盤、臍帶組織IDO、MIF mRNA相對表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.468、-0.455)，P均<0.01；胎盤、臍帶組織IDO mRNA表達(dá)水平與RI均呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.317、-0.526)，與新生兒體質(zhì)量均呈正相關(guān)(r分別為0.398、0.461)，P均<0.01；胎盤、臍帶組織MIF mRNA表達(dá)水平與RI均呈正相關(guān)(r分別為0.393、0.502)，與新生兒體質(zhì)量均呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.302、-0.431)，P均<0.01。結(jié)論 PE患者胎盤及臍帶組織中IDO表達(dá)降低、MIF表達(dá)升高，與胎兒RI升高和新生兒體質(zhì)量降低有關(guān)，可能參與PE的發(fā)病。

子癇前期；吲哚胺2，3-雙加氧酶；巨噬細(xì)胞移動抑制因子；炎癥因子；妊娠

子癇前期(PE)是妊娠特發(fā)性疾病，長期以來因其發(fā)病機(jī)制不明且缺乏有效治療方法而成為產(chǎn)科領(lǐng)域的一大困擾[1]。其特征性病理改變是血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及功能障礙，而過度炎癥刺激及氧化應(yīng)激是導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的直接原因。吲哚胺2，3-雙加氧酶(IDO)是機(jī)體重要的內(nèi)源性保護(hù)體系，其在母胎界面的適度表達(dá)是妊娠維持的保障[2]。巨噬細(xì)胞移動抑制因子(MIF)作為一種與炎癥密切相關(guān)的前驅(qū)因子，在PE的發(fā)病過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[3]。本研究觀察正常晚孕婦女及PE患者胎盤、臍帶組織中IDO、MIF的表達(dá)變化，并探討其意義?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2011年4月～2013年8月于滄州市人民醫(yī)院產(chǎn)科住院分娩的PE患者66例，其中輕度32例(輕度組)、重度34例(重度組)，PE診斷標(biāo)準(zhǔn)及分類依據(jù)參照第8版《婦產(chǎn)科學(xué)》。選擇同期健康晚孕婦女42例作為對照組，3組均為首次妊娠、單胎，均除外其他內(nèi)外科并發(fā)癥，無煙酒等不良嗜好，均以腰麻下剖宮產(chǎn)術(shù)結(jié)束分娩。輕度組年齡(26.8±4.4)歲、孕(37.9±0.6)周，重度組分別為(27.1±3.7)歲、(37.3±1.7)周，對照組分別為(26.0±3.5)歲、(38.0±0.5)周。各組年齡、孕周均具有可比性(P均>0.05)。

1.2 材料 兔抗人IDO多克隆抗體及兔抗人MIF多克隆抗體(美國分子標(biāo)記公司)，山羊抗兔IgG(中杉金橋)，總RNA極速抽提試劑盒(上海飛捷)，RT-PCR試劑盒(上海生工)，TC-XP-G基因擴(kuò)增儀(杭州博日)，GIS 1D(Ver.4.0)圖像分析軟件(上海天能)。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本處理方法 胎盤娩出后20 min內(nèi)，無菌狀態(tài)下取胎盤和臍帶組織各約1 g，冰上生理鹽水漂洗后分別置于1.5 mL無菌離心管中，液氮罐轉(zhuǎn)運(yùn)至-70 ℃冰箱保存。

1.3.2 胎盤和臍帶組織IDO、MIF mRNA檢測 采用RT-PCR法。提取胎盤及臍帶組織總RNA，嚴(yán)格參照試劑盒說明書操作。基因序列從GenBank獲得，Primer Premier5.0軟件設(shè)計引物序列，上海生工合成。IDO上游引物：5′-TTTGCTAAAGGCGCTGTTGG-3′，下游引物5′-CCTTCATACACCAGACCGTCTGA-3′，擴(kuò)增長度168 bp；MIF上游引物：5′-GCCCGGACAGGGTCTACA-3′，下游引物：5′-CTTAGGCGAA-GGTGGAGTTGTT-3′，擴(kuò)增長度125 bp；以GADPH為內(nèi)參，上游引物：5′-TCATGGGTGTGAACCATGAGAA-3′，下游引物：5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′，擴(kuò)增長度146 bp。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4 ℃ 5 min。取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物，15 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，結(jié)果用計算機(jī)掃描分析，IDO、MIF mRNA相對表達(dá)以目的基因與內(nèi)參基因擴(kuò)增條帶的實際灰度值的比值表示。

1.3.3 胎盤和臍帶組織IDO、MIF蛋白檢測 采用Western blot法。取-70 ℃保存的各組胎盤和臍帶組織樣品適量，液氮下研磨后移入預(yù)冷的勻漿管；加入等比例組織裂解液，冰浴中勻漿；將勻漿液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，4 ℃ 10 000 r/min離心約10 min；小心吸取上清液，分裝保存至新離心管中即為蛋白樣本，采用蛋白濃度測定試劑盒分別檢測各樣本中總蛋白濃度。以Action作為內(nèi)參，進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜，牛奶封閉、過夜。加入一抗、二抗，顯影，曝光，計算機(jī)掃描及分析系統(tǒng)檢測各條帶平均灰度值(A)，目的蛋白的相對表達(dá)量以目的條帶與內(nèi)參的A值比表示。

1.3.4 其他觀察指標(biāo) 各組均于產(chǎn)前2 d采用飛利浦iU Elite全身彩色超聲多普勒診斷儀(探頭頻率5.0 MHz)測定胎兒臍動脈血流阻力指數(shù)(RI)。記錄新生兒的體質(zhì)量。

2 結(jié)果

2.1 各組胎盤、臍帶組織IDO、MIF mRNA相對表達(dá)量比較 見表1。

2.2 各組胎盤、臍帶組織IDO、MIF蛋白相對表達(dá)量比較 見表2。

2.3 各組RI及新生兒體質(zhì)量比較 見表3。

2.4 各指標(biāo)相關(guān)性分析結(jié)果 PE患者中，胎盤、臍帶組織IDO、MIF mRNA相對表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.468、-0.455)，P均<0.01；胎盤、臍帶組織IDO mRNA表達(dá)水平與RI均呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.317、-0.526)，與新生兒體質(zhì)量均呈正相關(guān)(r分別為0.398、0.461)，P均<0.01；胎盤及臍帶組織MIF mRNA表達(dá)水平與RI均呈正相關(guān)(r分別為0.393、0.502)，與新生兒體質(zhì)量均呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.302、-0.431)，P均<0.01。

注：與對照組同一組織比較，*P<0.01；與輕度組同一組織比較，#P<0.01。

注：與對照組同一組織比較，*P<0.01；與輕度組同一組織比較，#P<0.01。

注：與對照組比較，*P<0.01；與輕度組比較，#P<0.01。

3 討論

PE是妊娠期特有疾病，其特征性病理改變?yōu)檠軆?nèi)皮細(xì)胞損傷和功能障礙，而過度炎癥刺激和氧化應(yīng)激是導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷的直接原因，但刺激因子的來源及其調(diào)控機(jī)制至今未明。研究發(fā)現(xiàn)，PE患者血清可損傷體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞[4]，而產(chǎn)后這一作用迅速消失。因此，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其損傷來源是一種急性短期應(yīng)激反應(yīng)，考慮與胎盤有關(guān)。

IDO是一種含亞鐵血紅素的單體蛋白，相對分子量42 kD，是肝臟以外催化Trp沿犬尿酸途徑分解代謝的惟一限速酶。其主要由外周血單核/巨噬細(xì)胞和胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞分泌，參與機(jī)體抗炎、抗感染及抗氧自由基等多種病理生理過程。正常情況下，體內(nèi)IDO呈低水平表達(dá)；在受到致炎因子及氧化應(yīng)激刺激時，IDO的表達(dá)升高，消耗局部微環(huán)境中的Trp及氧自由基，發(fā)揮清除氧自由基、抗炎及減輕炎癥損傷的作用[5]，是人體重要的內(nèi)源性保護(hù)體系之一。器官移植領(lǐng)域的大量研究證實，IDO可通過促使局部環(huán)境中Trp減少和犬尿酸增多來抑制T細(xì)胞增殖、促進(jìn)T細(xì)胞凋亡，參與并誘導(dǎo)同種異體移植免疫耐受、降低排斥反應(yīng)[6]。有關(guān)流產(chǎn)的多項研究也表明，正常的IDO表達(dá)及活性是妊娠得以維持的必要保障，其在母胎界面的表達(dá)減少是導(dǎo)致胎兒流失的高危因素[7]。而PE具有與流產(chǎn)相類似的免疫機(jī)制，且使用IDO抑制劑后，正常妊娠小鼠出現(xiàn)了類似PE的表現(xiàn)[8]。因此推測，IDO在母胎界面的表達(dá)變化與PE的發(fā)病有關(guān)，但其在母胎界面的精確定位報道不一，調(diào)節(jié)機(jī)制仍未明確。近年來有關(guān)PE發(fā)病機(jī)制的研究表明，系統(tǒng)性的炎癥反應(yīng)是PE發(fā)病的中心環(huán)節(jié)[9]。MIF作為炎癥反應(yīng)的前驅(qū)因子，主要由單核/巨噬細(xì)胞及活化的T細(xì)胞分泌，并儲備于胞質(zhì)中。當(dāng)機(jī)體受到應(yīng)激刺激時，MIF可迅速分泌出胞，吸引巨噬細(xì)胞向炎癥部位移動、聚集，并抑制其游走，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能。同時MIF可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌多種致炎因子，如TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6等[10]。已知IFN-γ是最主要的IDO激活物[11]，TNF-α、脂多糖(LPS)及IL-1等致炎因子可增強(qiáng)IFN-γ對IDO的激活作用。因此推測，IDO及MIF的表達(dá)變化可能在PE的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。

在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，IDO蛋白表達(dá)定位于胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及臍血管平滑肌細(xì)胞胞質(zhì)中，間質(zhì)也有少量表達(dá)，MIF蛋白與其具有共定位現(xiàn)象。本研究結(jié)果顯示，PE患者IDO mRNA及蛋白表達(dá)降低，且隨PE病情加重而降低，MIF則與之相反，二者呈負(fù)相關(guān)。推測可能由于正常妊娠為輕度炎癥反應(yīng)， MIF分泌較少，聚集巨噬細(xì)胞及上調(diào)炎癥因子的表達(dá)有限，因而促進(jìn)IFN-γ對IDO的激活作用誘導(dǎo)IDO表達(dá)升高，消耗局部微環(huán)境中Trp及氧自由基，發(fā)揮局部抗炎及抗氧化等保護(hù)作用維持妊娠；而PE由于存在過度炎癥反應(yīng)[9]，刺激大量儲備型MIF迅速分泌出胞，體內(nèi)致炎因子及氧自由基短時間內(nèi)迅速增加，導(dǎo)致局部IDO過度消耗，局部免疫保護(hù)缺失，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷加重，最終導(dǎo)致PE的發(fā)生。但這一推測仍待進(jìn)一步的驗證。前期的研究結(jié)果顯示，臍血管中膜平滑肌細(xì)胞MIF蛋白表達(dá)隨PE病情的加重而升高，推測與MIF上調(diào)前列腺素E2合成及縮血管作用加強(qiáng)有關(guān)[12]。

本研究同時發(fā)現(xiàn)，PE患者伴隨低體質(zhì)量兒出生，臨床監(jiān)測RI升高；且PE患者IDO mRNA及蛋白表達(dá)與RI均呈負(fù)相關(guān)、與新生兒體質(zhì)量均呈正相關(guān)，而MIF則與之相反。說明RI可作為臨床監(jiān)測胎兒發(fā)育情況、評判PE病情嚴(yán)重程度的敏感指標(biāo)，且操作較簡便。因此，PE患者胎盤及臍帶組織中IDO表達(dá)降低、MIF表達(dá)升高，與胎兒RI升高和新生兒體質(zhì)量降低有關(guān)，可能參與PE的發(fā)病，臨床上要加強(qiáng)對胎兒RI的監(jiān)測。今后的研究將進(jìn)一步深入探討IDO及MIF的調(diào)控機(jī)制，有助于明確PE的發(fā)病機(jī)理、研究防治措施，以及開發(fā)以IDO及MIF為靶點(diǎn)[13]的有效治療藥物等。

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河北省高等學(xué)校科學(xué)技術(shù)研究青年基金資助項目(QN20132002)。

張靜，E-mail: 18031793397@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2015.12.024

R714.244

B

1002-266X(2015)12-0061-03

2014-10-17)