白細胞介素-12B基因多態性與原因不明復發性流產的相關性分析

曹玉梅，吳振蘭，宋會會，趙建強，李玉潔，王振明

(1濰坊醫學院，山東濰坊261042；2濰坊市人民醫院)

白細胞介素-12B基因多態性與原因不明復發性流產的相關性分析

曹玉梅1，吳振蘭2，宋會會2，趙建強2，李玉潔2，王振明2

(1濰坊醫學院，山東濰坊261042；2濰坊市人民醫院)

目的 分析白細胞介素-12B(IL-12B)基因啟動子區多態性與原因不明復發性流產(URSA)的相關性。方法 URSA患者83例(URSA組)，同期門診體檢健康婦女90例(對照組)，采用RT-PCR法檢測兩組IL-12B基因多態性。結果 在IL-12B基因啟動子區共發現2個單核苷酸多態性，即-671G/T和-405G/T，兩組IL-12B基因-671G/T、-405G/T多態性分布差異均無統計學意義(P均>0.05)。URSA組-671T/-405G單體型比例(0.65%)高于對照組(0.41%)，P<0.05。結論 IL-12B基因啟動子區單體型-671T/-405G基因型可能與URSA發生有關。

復發性流產；白細胞介素-12B基因；單核苷酸多態性；相關性分析

原因不明復發性流產(URSA)發病率為1%～3%[1]，具體發病機制尚不清楚。白細胞介素-12(IL-12)是與免疫功能相關的細胞因子，在URSA的發生、發展過程中發揮重要作用。研究發現，IL-12B的基因啟動子區多態性影響IL-12B轉錄，但基因多態性與URSA相關性在不同種族不盡相同[2～4]。本研究探討IL-12B基因啟動子區多態性與中國北方漢族育齡期婦女URSA的相關性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2013年6月～2014年6月濰坊市人民醫院住院URSA患者83例(URSA組)，年齡21～41(30.43±4.34)歲，均根據臨床癥狀、現病史、既往史、家族史、查體及輔助檢查等多項指標評定后確診。另選同期門診體檢健康婦女90例作為對照組，年齡25～43(31.26±3.86)歲，妊娠均≥2次，無不良妊娠史。兩組年齡具有可比性；均為中國漢族，相互間無血緣關系。

1.2 方法

1.2.1 IL-12B基因多態性檢測 采用RT-PCR法。①兩組分別取外周靜脈血3 mL，EDTA抗凝，提取DNA。②引物設計與合成根據NCBI發表的IL-12B基因序列(GeneBank ID AY008847)，第1對引物上游：5′-TGAGGCTCAGCGAGTAACTT-3′，下游：5′-AGACCACACCTTGAGAACCA-3′，擴增長度740 bp；第2對引物上游：5′-TGCTGAATCAGACACTCTGG-3′，下游：5′-ACCAACTGCTGGTGACACAT-3′，擴增長度830 bp。引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。③ PCR擴增，反應體系25 μL；反應條件：95 ℃預變性5 min、94 ℃變性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s，共循環35次；72 ℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。④隨機選取部分樣品的PCR產物，進行序列測定(南京金斯瑞生物科技有限公司)，確定-671 G/T和-405 G/T位點的基因型，同時對酶切結果進行驗證，以保證結果的可靠性。

1.2.2 統計學方法 采用擬合優度χ2檢驗，檢測L-12B基因啟動子區位點基因型頻率、等位基因頻率是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。采用在線軟件平臺SHEsis 分析單體型數據[5]。采用SPSS19.0統計軟件，計數資料比較采用χ2檢驗，P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

IL-12B基因啟動子區位點的基因型頻率符合Hardy-Weinberg平衡定律。在IL-12B基因的啟動子區共發現2個功能單核苷酸，即-671G/T和-405G/T，兩組IL-12B基因-671G/T、-405G/T多態性分布見表1、2。-671G/T和-405G/T等位基因頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律。兩組-671G/T和-405G/T構成的3種單體型比較見表3。

3 討論

IL-12作為一種炎性細胞因子，是連接早期非特異免疫反應和繼發抗原特異性免疫反應的橋梁，主要由抗原激活的單核/巨噬細胞、樹突細胞等抗原遞呈細胞產生，通過調節Th1、Th2比例，在淋巴細胞介導的免疫過程中發揮重要作用[6,7]。IL-12是由IL-12A(P30)和IL-12B(P40)兩個亞基組成。IL-12A(P30)基因易感性研究相對較少。IL-12B具有基因多態性，國內外的許多研究已經發現，IL-12B啟動子、rs321309、外顯子5′、3′UTR基因多態性與疾病相關。如Morahan等[8]認為，3′UTR等位基因高表達與結核病相關；周林等[9]認為，rs321309可能與寧夏人群強直性脊柱炎患病風險有關聯；張雄等[10]認為，3′UTR(A>C)多態性可能是亞洲人群宮頸癌和鼻咽癌易患性增加的危險因素之一。

正常妊娠時Th1/Th2免疫反應保持平衡，母胎界面以Th2型細胞因子占主導地位，發揮免疫營養作用。當Th1/Th2比值變化向Th1偏離時，則可能損傷胎盤滋養細胞及胎兒，導致URSA患者Th1型因子分泌IL-2、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、干擾素γ(IFN-γ)等，介導細胞免疫、炎癥反應，對胚胎生長發育不利。而IFN-γ與IL-12存在正反饋循環，IFN-γ及促進IFN-γ增加的因素都能促進IL-12產生，反之，IL-12增加亦可促進IFN-γ的產生。所以，IL-12的表達可間接導致復發性流產的發生。Wilson等[11]發現，復發性流產患者血清IL-12水平明顯高于正常未孕婦女。

URSA作為一種多基因遺傳病，其遺傳易感性可能是由多個功能單核苷酸的遺傳變異所決定，并受環境因素影響。對于多基因疾病易感基因的鑒定，雖然目前還沒有最好的方法，但通過連鎖分析結合關聯分析及生物學功能研究，找到了一些多基因疾病的易感基因，如IL-23R是強直性脊柱炎的易感基因[12]、miR-499基因是高度宮頸上皮內瘤變的易感基因[13]、ADAM33基因是慢性阻塞性肺疾病的易感基因[14]。

本研究選取中國漢族URSA患者為研究對象，在IL-12B基因的啟動子區共發現2個功能單核苷酸，即-671G/T和-405G/T，URSA組、對照組IL-12B基因-671G/T、-405G/T多態性分布差異均無統計學意義，URSA組-671T/-405G單體型比例多對照組；提示IL-12B基因啟動子區的-671G/T、-405G/T基因型與URSA發生無關聯，單體型-671G/-405G可能與URSA的遺傳易感性有關，但其在URSA易感性中的作用和機制尚需進一步研究證實。

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吳振蘭，E-mail: wuzhenlan.wf@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2015.12.025

R714.21

B

1002-266X(2015)12-0064-02

2014-08-21)