白藜蘆醇對帕金森病小鼠行為表現(xiàn)及對多巴胺能神經(jīng)元NF-κB蛋白表達的影響

徐芳(棗莊科技職業(yè)學院，山東滕州277599)

白藜蘆醇對帕金森病小鼠行為表現(xiàn)及對多巴胺能神經(jīng)元NF-κB蛋白表達的影響

徐芳
(棗莊科技職業(yè)學院，山東滕州277599)

摘要:目的探討白藜蘆醇對帕金森病( PD)小鼠行為表現(xiàn)及對多巴胺( DA)能神經(jīng)元核轉(zhuǎn)錄因子-κB( NF-κB)蛋白表達的影響。方法①體內(nèi)實驗: 50只雌性褐鼠隨機均分為五組，1組模仿卵巢切除術行假手術; 2組行雙側(cè)卵巢切除術; 3組手術同2組，術后1周腹腔注射生理鹽水連續(xù)4 d，腹腔注射MPTP連續(xù)7 d; 4組手術同2組，術后1周腹腔注射白藜蘆醇連續(xù)4 d，腹腔注射MPTP連續(xù)7 d; 5組手術同2組，術后1周腹腔注射雌激素連續(xù)4 d，腹腔注射MPTP連續(xù)7 d;比較各組爬桿實驗得分。②體外實驗:當體外培養(yǎng)的MES23.5 DA能細胞密度達到60%時，A組換用無血清培養(yǎng)基; B組換用加有MPP +的無血清培養(yǎng)基; C組較前兩組提前30 min換用加有白藜蘆醇的無血清培養(yǎng)基進行預處理，30 min后換用同時含有白藜蘆醇和MPP +的無血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，采用Western blotting法檢測三組細胞中NF-κB蛋白。結(jié)果1、2、3、4、5組爬桿實驗得分分別為( 8.39±1.21)、( 5.62±0.90)、( 3.79±1.17)、( 8.01±1.03)、( 8.27±1.39)分; 2、3組得分低于其他三組，P均＜0.05。B組細胞質(zhì)NF-κB蛋白表達量較A組減少約57%( P＜0.05)，C組細胞質(zhì)NF-κB蛋白表達量較B組增加約54%( P＜0.05)。B組細胞核NF-κB蛋白表達量較A組增加約76% ( P＜0.05)，C組細胞核NF-κB蛋白表達量較B組減少62% ( P＜0.05)。結(jié)論白藜蘆醇可減輕MPTP致PD小鼠行為學表現(xiàn)，機制可能與其抑制DA能神經(jīng)元內(nèi)NF-κB核易位有關。

關鍵詞:帕金森病;白藜蘆醇;核轉(zhuǎn)錄因子-κB;核易位;小鼠

帕金森病( PD)主要病理改變是中腦黑質(zhì)多巴胺( DA)能神經(jīng)元進行性變性缺失，但其確切病因和發(fā)病機制尚不清楚［1］。天然提取物白藜蘆醇屬于植物雌激素，具有抗氧化損傷和抑制炎癥反應等作用。研究證實，白黎蘆醇能有效保護中樞神經(jīng)元，如能減輕6-OHDA誘導的PD大鼠黑質(zhì)DA能神經(jīng)元凋亡及其氧化應激損傷［2］。2012年7月～2014 年6月，本研究觀察白藜蘆醇對MPTP致PD小鼠的神經(jīng)保護作用，并探討其作用機制。

1　材料與方法

1.1材料10～12周齡、體質(zhì)量25～30 g的C57/BL雌性褐鼠(對MPTP敏感性高) 50只，自由生活在12 h∶12 h晝夜循環(huán)光照環(huán)境中，室溫( 19± 2)℃。MES23.5 DA能細胞系由美國PD研究所樂衛(wèi)東教授惠贈。MPTP、MPP +、白藜蘆醇均為Sigma公司產(chǎn)品; NF-κB抗體( 1∶200)、細胞增殖核抗原( PCNA)、羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG均為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品;β-actin抗體( 1∶500)為博奧森公司產(chǎn)品。

1.2體內(nèi)實驗

1.2.1動物分組及處理取50只雌性褐鼠，隨機分為五組，每組10只: 1組:水合氯醛麻醉后，模仿卵巢切除術行假手術;術后1周腹腔注射生理鹽水，1次/d，連續(xù)11 d。2組:麻醉同前，行雙側(cè)卵巢切除術;術后1周腹腔注射生理鹽水，1次/d，連續(xù)11 d。3組:手術同2組;術后1周腹腔注射生理鹽水，1次/d，連續(xù)4 d;然后腹腔注射MPTP( 20 mg/kg)，1次/d，連續(xù)7 d。4組:手術同2組;術后1周腹腔注射白藜蘆醇( 30 mg/kg)，1次/d，連續(xù)4 d;然后腹腔注射MPTP( 20 mg/kg)，1次/d，連續(xù)7 d。5組:手術同2組;術后1周腹腔注射雌激素( 50 mg/kg)，1次/d，連續(xù)4 d;然后腹腔注射MPTP( 20 mg/kg)，1次/d，連續(xù)7 d。

1.2.2行為學觀察給藥后立即觀察各組是否出現(xiàn)豎毛、動作減少、尾巴過伸等急性PD癥狀。同時進行爬桿實驗，記錄小鼠從小球上下來所需時間、爬完桿子上半部所需時間、爬完桿子下半部所需時間［3］。

1.3體外實驗

1.3.1細胞培養(yǎng)MES23.5 DA能細胞接種于預先涂有多聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基為含有5%胎牛血清及2% Sato's的DMEM/F12培養(yǎng)基，培養(yǎng)

環(huán)境為37℃、5% CO2溫箱。采用倒置顯微鏡觀察細胞，根據(jù)其生長情況進行傳代。

1.3.2細胞分組與藥物處理取對數(shù)生長期細胞，以2×104/mL接種于6孔板中，隨機分為三組: A組換用無血清培養(yǎng)基; B組換用加有MPP + ( 10 μmol/L)的無血清培養(yǎng)基; C組較前兩組提前30 min換用加有白藜蘆醇( 10 μmol/L)的無血清培養(yǎng)基進行預處理，30 min后換用同時含有白藜蘆醇( 10 μmol/L)和MPP +( 10 μmol/L)的無血清培養(yǎng)基。

1.3.3細胞中NF-κB蛋白檢測三組細胞培養(yǎng)24 h后利用蛋白抽提試劑盒分別提取總蛋白、漿蛋白和核蛋白，分別加適量生理鹽水維持每份體積相同。采用Western blotting法檢測三組細胞中NF-κB蛋白。

1.4統(tǒng)計學方法采用PPMS1.5統(tǒng)計軟件。計量資料采用珋x±s表示;兩組間均數(shù)比較采用Student's t檢驗;兩組以上均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Turkey's檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1各組行為表現(xiàn)3組注射MPTP后，立即出現(xiàn)豎毛、動作減少、尾巴過伸等急性PD癥狀，對外界刺激反應明顯遲鈍; 4、5組出現(xiàn)相同癥狀，但癥狀輕、恢復快; 1、2組未見上述行為。1、2、3、4、5組爬桿實驗得分分別為( 8.39±1.21)、( 5.62±0.90)、( 3.79±1.17)、( 8.01±1.03)、( 8.27±1.39)分; 2、3組得分低于其他三組，P均＜0.05;其余組間比較，P均＞0.05。

2.2各組細胞NF-κB蛋白表達B組細胞質(zhì)NF-κB蛋白表達量較A組減少約57%( P＜0.05)，C組細胞質(zhì)NF-κB蛋白表達量較B組增加約54% ( P＜0.05)。B組細胞核NF-κB蛋白表達量較A組增加約76%( P＜0.05)，C組細胞核NF-κB蛋白表達量較B組減少為62%( P＜0.05)。

3　討論

目前，PD的治療主要以對癥治療為主，無法延緩或阻止中樞DA能神經(jīng)元變性［4］。雌激素具有中樞神經(jīng)元保護作用。更年期婦女給予雌激素替代治療，可以降低PD的發(fā)病率，緩解PD患者早期運動障礙、提高其認知能力。但是，雌激素替代治療增加乳腺癌及子宮內(nèi)膜癌等的發(fā)病率。因此，開發(fā)雌激素替代品非常重要。白黎蘆醇為植物提取物，其母核結(jié)構(gòu)類似于己烯雌酚，與經(jīng)典的核內(nèi)雌激素受體( ER)結(jié)合后，發(fā)揮雌激素樣作用，可改善婦女更年期綜合征癥狀，預防乳腺癌、骨質(zhì)疏松癥、心血管疾病等發(fā)生。

本研究結(jié)果表明，注射MPTP后PD模型小鼠馬上出現(xiàn)豎毛、動作減少等急性PD癥狀，對外界刺激反應明顯遲鈍，爬桿實驗得分最低;說明MPTP致PD模型制備成功。白藜蘆醇預處理和雌激素對照小鼠也出現(xiàn)相同癥狀，但癥狀輕、恢復快;爬桿實驗得分較PD模型小鼠明顯提高;說明白藜蘆醇對PD小鼠具有神經(jīng)保護作用，且其神經(jīng)保護作用與雌激素效果相當。Panet等［5］發(fā)現(xiàn)，NF-κB能夠促進氧化應激所造成的DA能神經(jīng)元退行性變。生理狀態(tài)下NF-κB存在于細胞質(zhì)中，與IκB結(jié)合形成復合物;該復合物發(fā)生磷酸化被激活后，解離出IκB，進入細胞核，與誘導性一氧化氮合酶( iNOS)結(jié)合，誘導iNOS轉(zhuǎn)錄［6］。激活的NF-κB能夠促使DA能神經(jīng)元內(nèi)p53、c-Myc基因表達，導致細胞增殖及死亡［7］。研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇能夠通過抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)移，進而抑制糖尿病患者血管平滑肌異常增殖［8］。抑制星形膠質(zhì)細胞內(nèi)NF-κB激活，可對PD患者DA能神經(jīng)元發(fā)揮保護作用［9］。本研究結(jié)果表明，白藜蘆醇可以抑制MPP +對NF-κB的激活作用，進而抑制MPP +致MES23.5 DA能神經(jīng)元損傷。

綜上所述，白藜蘆醇可減輕MPTP致PD小鼠的行為學表現(xiàn)，機制可能與其抑制DA能神經(jīng)元內(nèi)NF-κB核易位有關。

參考文獻:

［1］王茜，張宇新，張作鳳.核因子NF-κB對帕金森病MPTP模型小鼠黑質(zhì)COX-2表達的影響［J］.第四軍醫(yī)大學學報，2008，29 ( 19) : 1758-1760.

［2］金鳳，吳芹.白藜蘆醇對帕金森病模型大鼠氧化應激損傷的拮抗效應［J］.遵義醫(yī)學院學報，2009，32( 1) : 222-224.

［3］郭德玉，于向東，陳彪，等.MPTP致C57BL/6小鼠帕金森病模型的復制及常用的行為學分析方法［J］.實驗動物科學，2010，27 ( 2) : 1-4.

［4］王健，彭國光.培高利特對帕金森病大鼠保護作用的初步研究［J］.重慶醫(yī)學，2006，32( 6) : 729-730.

［5］Panet H，Barzilai A，Daily D，et al.Activation of nuclear transcription factor kappa B ( NF-kappaB) is essential for dopamine-induced apoptosis in PC12 cells［J］.J Neurochem，2001，77( 2) : 391-398.

［6］曾麗平，馬韻.NF-κB與彌漫性大B細胞淋巴瘤的關系研究進展［J］.當代醫(yī)學，2010，16( 7) : 34-35.

［7］Yang HJ，Wang L，Xia YY，et al.NF-kappaB mediates MPP + -induced apoptotic cell death in neuroblastoma cells SH-EP1 through JNK and c-Jun/AP-1［J］.Neurochem lnt，2010，56( 1) : 128-134.

［8］李佳，姜鮮，章卓.白藜蘆醇對糖尿病大鼠血管平滑肌細胞增殖的影響［J］.重慶醫(yī)學，2010，39( 14) : 1822-1826.

［9］Aoki E，Yano R，Yokoyama H，et al.Role of nuclear transcription factor kappa B ( NF-kappaB) for MPTP ( 1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahyropyridine) -induced apoptosis in nigral neurons of mice ［J］.Exp Mol Pathol，2009，86( 1) : 57-64.

收稿日期:( 2014-10-23)

文章編號:1002-266X( 2015) 28-0032-02

文獻標志碼:A

中圖分類號:R742.5

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.28.011