定量體視學技術在口腔基礎醫學研究中的應用進展

趙麗娟，姜莉鋮，杜平功，曲偉棟，張彬

(1濱州醫學院附屬煙臺市口腔醫院，山東煙臺264001;2聊城市人民醫院)

體視學是一門新興的高度交叉但已獨立的學科，具有國內外公認的學科名稱與明顯的學科特點［1］，其核心內容為“研究立體或三維結構的科學”。近幾十年來，隨著現代體視學方法尤其是定量體視學技術的不斷完善，其應用范圍不斷拓展［2］，已在生物醫學領域廣泛應用。定量體視學技術在國外口腔醫學領域應用范圍廣泛，但是，我國口腔醫學領域定量體視學技術的應用范圍相對較窄，主要用應于口腔基礎醫學的研究，現將其應用進展情況綜述如下。

1 定量體視學技術

體視學最早于1961年由德國生物學家和數學家提出，1965年國際上才開始出現標有“stereology”的體視學研究方面的論著，中國直到1985年才開始涌現出較高水平的體視學方面的研究文章［3，4］。近幾十年來，隨著現代體視學方法的不斷完善，定量體視學技術的應用范圍不斷拓展［2］。生物醫學體視學是指由組織、器官和(或)細胞等的二維測量數據，推論、分析其三維結構定量信息的一門介于形態學與數學之間的邊緣科學，它通過定量測試平面圖像上的幾何信息，如粒子截面的面積、周長、直徑、點密度、交點密度等，再根據有關體視學公式推導出其三維結構信息，如體積、體積密度、表面積密度、數密度等，進而從三維水平定量認識組織和細胞的結構特點［5］。定量體視學技術是一種有效、客觀、無系統偏差的方法;數學上的無偏性是體視學方法固有的且無需證明的特性［6］。根據體視學抽樣原則，在應用體視學方法時，體積、表面積和曲線長度等可被評估而無任何系統誤差［7］。體視學方法在對組織、器官等的參數測量中具有效率高、成本低、速度快、準確性高、重復性好等特點;如果重復進行測量，則測量的平均值即為所測目標的真實數值［2，6］。

體視學測試(測量)的基本工具是點、線、框(面)3種幾何元素或者說“探針”(亦稱為測試系統)。體視學測試實質相當于先把“探針”隨機“插入”包含所測結構的組織器官內，然后根據探測結果(測點是否位于所測結構內、測線與所測結構界面是否形成交叉等)來統計分析所測結構的幾何特征。體視學基本測試方法包括測點計數、交點計數、輪廓計數、粒子計數、Feret直徑測量、焦距測量以及點取截距測量等［5，8］。體視學包括4類基本參數，即密度參數、形狀參數、尺寸參數、分布參數，應用這些參數，可以對幾乎所有生物醫學領域、學科涉及到的形態學問題進行定量研究(即定量體視學技術)，但必須根據所要定量的組織結構特點選用恰當的參數［8］。

2 定量體視學技術在口腔基礎醫學研究中的應用

定量體視學技術在國外口腔醫學領域應用范圍廣泛，包括口腔腫瘤病理學、口腔頜面外科學、口腔種植學、牙周病學、口腔黏膜病學、口腔材料學、口腔解剖學、口腔微生物學等相關學科，其在口腔放射影像學中的研究近年來亦有報道，但報道數量相對較少。相對于國外的研究，中國口腔醫學中有關定量體視學技術的應用報道較少，應用范圍也相對較窄，其應用多集中在口腔基礎醫學，主要包括口腔病理學及口腔解剖學領域。

2.1 定量體視學技術在口腔病理學領域的應用定量體視學技術已用于一些腫瘤細胞的形態定量研究，為病理診斷的定量分析與預后判斷奠定了基礎;另外，體視學在分析癌細胞漸變過程、組織受損程度、患者預后效果等方面均具有較大的實用價值［9～12］。定量體視學技術能夠獲取組織切片微觀結構的三維數據(包括體積、表面積、長度及組織、器官、細胞、細胞器的數量等)，而這些定量的信息有益于評估特殊器官、組織、細胞的實驗性治療效果［13，14］。

Liu等［15］利用定量體視學技術，觀察了口腔疣狀癌3種臨床分型的超微結構特征，及其與口腔鱗癌之間的區別。具體方法為取正常口腔黏膜，口腔疣狀癌外生型、囊腫型、浸潤型，口腔高分化鱗癌及中、低分化鱗癌，各5例，常規電鏡制樣，觀察各型的超微結構特征，并用體視學方法測量每組細胞的細胞核體密度、核質比、橋粒、細胞內橋粒、線粒體密度，并進行對比分析。蔡揚等［16］應用定量體視學技術對7例正常口腔黏膜組織、16例口腔扁平苔蘚、12例伴輕中度上皮異常增生的口腔白斑以及10例口腔高分化鱗癌組織進行分析。以上兩個研究結果均顯示，二維參數可較好地反映惡變過程中細胞的形態變化特征，而三維參數則突出了細胞核在腫瘤發生過程中的特征變化，二維定量、三維定量結合可更全面地反映口腔黏膜上皮由正常至病變至癌變過程中細胞及細胞核的量變、質變過程，并能較好地將口腔癌與非癌病變鑒別［15，16］。Caldeira 等［17］采用定量體視學技術測定了長期接受胰島素治療的糖尿病裸鼠的唾液腺組織的顯微結構，包括細胞核和細胞質體積、長短軸等。李健等［18］采用體視學形態定量的計算方法，以大鼠腮腺為模型，對堿性成纖維細胞生長因子治療腮腺創傷的組織變化進行了研究，發現治療組腺泡面積、間質量、導管數量及核質比例等指標的絕對值均優于對照組，為探索腮腺瘺的預防及治療提供新思路。Li等［19］將體視學技術與放射學、組織學以及其他方法聯合應用，探討地塞米松修復雄性SD大鼠下頜骨臨界缺損的效果，結果發現短期全身應用地塞米松可破壞骨的早期愈合。Schou等［20］通過定量體視學體視學等方法，評估了無機多孔牛源性骨礦物質粉(Bio-Oss骨粉)和擴張的聚四氟乙烯(ePTFE)膜治療種植體周圍炎的效果，發現用膜覆蓋Bio-Oss治療的骨缺損處其新的骨性結合的量和總的骨量(包括Bio-Oss和再生骨)明顯多于單純Bio-Oss組、單純ePTFE膜組以及對照組(傳統組織瓣組)。

臨床上對于腫瘤或其他測量目標的定量判斷各個醫生不盡相同，結合定量體視學技術來估算可以避免人為和心理方面等主觀因素的影響，也可提高獲得目標三維信息的有效性及準確性。

2.2 定量體視學技術在口腔解剖學領域的應用White等［21］在試驗觀察性隊列研究中運用體視學方法，比較通過共焦反射顯微鏡獲得的無創活體人類口腔黏膜圖像與通過傳統組織學所獲得的圖像，結果發現二者無論在定性方面還是定量方面都具有良好的相關性。Barghash等［22］應用定量體視學技術從組織學水平評估擠壓傷后面神經、頦神經的退化變性和再生，發現面神經(運動神經)再生模式的組織學改變比頦神經(感覺神經)再生模式的組織學改變速度更快且更加完整;而二者退化變性模式的組織學改變未發現明顯差異。譚偉兵等［23］選用了體視學的方法，對面部鼻唇區和下唇區的皮膚真皮淺層、真皮深層和真皮下面的淺筋膜層微細血管進行三維空間定量分析，并對兩區微細血管長度密度、平均直徑、表面積密度分別進行比較，發現兩區微細血管長度密度、平均直徑和表面積密度差別無統計學意義，說明兩區相同層次之間的微細血管密度具有大致相似的特征。

對顳肌肌梭的體視學研究發現，顳肌肌梭分布呈不均質性，顳肌前份纖維具有靠近喙突處成簇分布的特點，有時也可見肌梭聯合體，顳肌后緣及上端則少有肌梭分布，后份纖維肌梭多以較大的單個體形式散在分布［24，25］;提示咀嚼肌的肌構筑特征和肌梭分布能體現咀嚼肌在參與下頜運動時所產生的張力、速度以及調節下頜運動的能力，肌亞部的劃分與神經支配范圍、肌的構筑特征及肌梭分布有密切關聯［24，25］。

2.3 定量體視學技術在口腔材料學及口腔微生物學領域的應用 Mackert等［26］應用定量體視學方法分析牙科瓷材料相關參數，如顯微裂紋密度、白榴石粒子表面積體積比等，發現當平均白榴石粒子直徑＜4 μm 時，牙科瓷材料顯微裂紋最少。Dige等［27］采用體視學技術原位量化牙齒完整生物膜中的細菌，結果顯示隨著時間的推移細菌總數和鏈球菌數量顯著增加，且在每個檢測時間點都具有明顯的個體差異;提示在早期生物膜形成過程中聯合應用熒光原位雜交技術和定量體視學技術獲取無偏的、定量的特殊細菌數量及種群的方法是可靠的、可行的。

綜上所述，定量體視學技術是一種基于數學幾何原理的、快速的、無偏的、可重復的、非侵入性的定量測量方法，能夠量化表達組織結構中的有關變化，可廣泛應用于口腔頜面醫學的諸多領域。定量體視學技術有助于口腔良惡性病變的診斷，口腔惡性腫瘤的治療及預后預測，可為于口腔非腫瘤病變與腫瘤病變、良性腫瘤與惡性腫瘤的鑒別診斷提供定量參數及標準。然而，目前體視學研究理論和方法在國內口腔醫學研究存在應用范圍窄、體視學參數相對單一等缺點。在今后的研究中，擴大定量體視學技術在口腔醫學中的應用范圍，應充分認識和發揮體視學的長處，進一步拓展、發掘新的體視學參數，注意多種參數的聯合應用是十分必要的。

［1］劉國權.三維結構與體視學［J］.中國體視學與圖像分析，2014，19(1):1-10.

［2］Mandarim-De-Lacerda CA.Stereological tools in biomedical research［J］.An Acad Bras Cienc，2003，75(4):469-486.

［3］Weibel ER.Stereological methods.Vol.1:Practical methods for biological morphometry［M］.London:Academic Press，1979:131-132.

［4］周新憲，宇新，苗鴻才.基于web of science數據庫的體視學文獻計量分析研究［J］.中國體視學與圖像分析，2010，15(2):219-225.

［5］West MJ.Basic Stereology for Biologists and Neuroscientists［M］.NewYork:CSHL Press，Cold Spring Harbor，2012:843-851.

［6］Roberts N，Puddephat M，Mcnulty V.The benefit of stereology for quantitative radiology［J］.Br J Radiol，2000，73(871):679-697.

［7］Altunkaynak BZ，Onger ME，Altunkaynak ME，et al.A brief introduction to stereology and sampling strategies:basic concepts of stereology［J］.Neuroquantology，2012，10(1):31-43.

［8］楊正偉.生物組織形態定量研究基本工具:實用體視學方法［M］.北京:科學出版社，2012:1-19.

［9］Carus A，Ladekarl M，Hager H，et al.Tumour-associated cd66b+neutrophil count is an independent prognostic factor for recurrence in localised cervical cancer［J］.Br J Cancer，2013，108(10):2116-2122.

［10］Laurinavicius A，Plancoulaine B，Laurinaviciene A，et al.A methodology to ensure and improve accuracy of ki67 labelling index estimation by automated digital image analysis in breast cancer tissue［J］.Breast Cancer Res，2014，16(2):R35.

［11］Leze E，Maciel-Osorio CF，Mandarim-De-Lacerda CA.Advantages of evaluating mean nuclear volume as an adjunct parameter in prostate cancer［J］.PLoS One，2014，9(7):e102156.

［12］申玉梅，申洪.鼻咽癌發展過程中細胞超微結構的體視學研究［J］.實用醫學雜志，2010，26(15):2697-2700.

［13］Bulut E，Bas B，Altunkaynak B，et al.Efficacy of ankaferd blood stopper on bone healing in diabetic rats:A stereological and histopathological study ［J］.Biotech Histochem，2014，9(7):535-543.

［14］Walloe S，Pakkenberg B，Fabricius K.Stereological estimation of total cell numbers in the human cerebral and cerebellar cortex［J］.Front Hum Neurosci，2014，8(508):1-9.

［15］Liu O，Zhang H，Wang Y，et al.Stereology study of oral verrucous carcinoma［J］.J BUON，2012，17(2):343-349.

［16］蔡揚，于燕妮，柳詠發，等.口腔扁平苔蘚、白斑及鱗癌棘細胞形態計量學分析［J］.實用口腔醫學雜志，2006，22(3):404-407.

［17］Caldeira EJ，Camilli JA，Cagnon VH.Stereology and ultrastructure of the salivary glands of diabetic nod mice submitted to long-term insulin treatment［J］.Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol，2005，286(2):930-937.

［18］李健，李嘉琥，宋宇峰，等.外源性堿性成纖維細胞生長因子促進腮腺創傷修復的實驗研究［J］.西南國防醫藥，2004，14(2):132-133.

［19］Li J，Wang X，Zhou C，et al.Perioperative glucocorticosteroid treatment delays early healing of a mandible wound by inhibiting osteogenic differentiation［J］.Injury，2012，43(8):1284-1289.

［20］Schou S，Holmstrup P，Jorgensen T，et al.Anorganic porous bovine-derived bone mineral(bio-oss)and eptfe membrane in the treatment of peri-implantitis in cynomolgus monkeys［J］.Clin Oral Implants Res，2003，14(5):535-547.

［21］White WM，Rajadhyaksha M，Gonzalez S，et al.Noninvasive imaging of human oral mucosa in vivo by confocal reflectance microscopy［J］.Laryngoscope，1999，109(10):1709-1717.

［22］Barghash Z，Larsen JO，Al-Bishri A，et al.Degeneration and regeneration of motor and sensory nerves:a stereological study of crush lesions in rat facial and mental nerves［J］.Int J Oral Maxillofac Surg，2013，42(12):1566-1574.

［23］譚偉兵，張永福，袁龍慶.鼻唇溝皮瓣和下唇皮瓣微細血管的定量研究［J］.江西醫學院學報，2000，40(4):113-114.

［24］Zhang YR，Liu J，Huang Y.Stereology investigation of muscle spindles in human masseter and temporalis muscle［J］.Hua Xi Kou Qiang Yi Xue Za Zhi，2006，24(5):419-422.

［25］張躍蓉，劉靜.人顳肌亞部化及其肌內神經分布研究［J］.暨南大學學報(自然科學與醫學版)，2009，30(6):619-622.

［26］Mackert JR Jr，Twiggs SW，Russell CM，et al.Evidence of a critical leucite particle size for microcracking in dental porcelains［J］.J Dent Res，2001，80(6):1574-1579.

［27］Dige I，Nyengaard JR，Kilian M，et al.Application of stereological principles for quantification of bacteria in intact dental biofilms［J］.Oral Microbiol Immunol，2009，24(1):69-75.