多色熒光原位雜交技術在尿脫落細胞學陰性膀胱癌患者術后隨訪監測中的應用

王南雄，王尉，呂軍，王健，葉純

(1公安邊防總醫院，廣東深圳518000;2廣州軍區廣州總醫院)

膀胱尿路上皮癌占膀胱癌90%以上，其發病率和病死率呈逐年上升趨勢［1］。初發膀胱癌病例中75%以上為非肌層浸潤性膀胱癌，可行經尿道膀胱腫瘤切除術，術后輔以膀胱灌注治療，療效較好，但術后復發率較高［1，2］。因此，膀胱癌術后需長期隨訪監測。標準的監測方案包括膀胱鏡和尿脫落細胞學檢查，前者有創傷性，且有10% ～30%的假陰性;后者是無創檢查，對低分級腫瘤的敏感性較低［2］。自2001年美國FDA批準熒光原位雜交技術(FISH)用于臨床以來，因其非侵入性的優勢得到較好發展。與尿脫落細胞學比較，M-FISH敏感性較高，但特異性上無任何優勢［3，4］。目前國內采用較多的是多色熒光原位雜交技術(M-FISH)，在尿脫落細胞學檢查為陰性的膀胱癌患者中是否適合行M-FISH隨訪監測，目前鮮有研究報道。2011年1月～2013年10月，我們對尿脫落細胞學陰性的76例膀胱癌術后患者進行M-FISH監測。現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2011年1月～2013年10月于廣州軍區總醫院泌尿外科住院且經尿道進行膀胱腫瘤切除術的膀胱尿路上皮癌患者76例，男54例(71.1%)、女22 例(28.9%)，年齡 43 ～80 歲、平均64歲。低級別尿路上皮癌59例(77.6%)，高級別尿路上皮癌17例(22.4%);非肌層浸潤性膀胱癌(Tis～T1)58例(76.3%)，肌層浸潤性膀胱癌(T2～T4)18例(23.7%)。76例患者術前尿脫落細胞學檢查均陰性(巴氏分級Ⅰ～Ⅱ級)，即排除可疑或陽性患者，術后監測隨訪時間(19±10)個月，隨訪間期為3個月，尿脫落細胞學檢查結果均陰性。患者均簽署知情同意書。另收集10例健康者的尿脫落細胞作為正常對照。

1.2 M-FISH監測方法 每例患者隨訪當日收集晨尿100～200 mL，2 h內送檢。M-FISH標本制備及雜交嚴格按M-FISH試劑盒說明書進行操作，使用3、7、17、9p21 號染色體探針，每次檢測時均用健康者尿脫落細胞作為正常對照，以驗證探針的有效性。用奧林巴斯BX51熒光顯微鏡觀察熒光雜交信號并采集圖像，CytoVision3.0軟件進行圖像分析。雜交面積用×40倍物鏡檢視掃描，主要觀察異常細胞［細胞核形狀不規則、細胞核體積增大、4，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染色不均勻和細胞群集(可疑惡性不重疊的成簇細胞)］。至少觀察25個形態異常的細胞，確定以上4種探針的拷貝數。M-FISH陽性標準:至少有4個細胞3、7、17號染色體探針2種或以上出現拷貝數擴增和(或)至少有12個細胞出現9p21信號完全缺失。

1.3 膀胱鏡檢查方法 膀胱鏡檢查中發現有可疑病灶或明確腫瘤的患者做活檢或進行經尿道膀胱腫瘤切除術，記錄膀胱鏡下觀察到的腫瘤大小、形狀、位置和數目。病理檢查根據2004年WHO膀胱尿路上皮癌惡性程度分級系統標準進行。

1.4 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件。率的比較采用χ2檢驗。特異性=真陰性/(真陰性+假陽性)，敏感性=真陽性/(真陽性+假陰性);陽性預測值=真陽性/(真陽性+假陽性)，陰性預測值=真陰性/(真陰性+假陰性)。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

76例尿脫落細胞學檢查均陰性膀胱癌患者中14例(18.4%)復發，M-FISH 僅檢出3例(3.9%)復發，漏診11例(14.5%)。膀胱鏡檢查結果為陰性54例，其中M-FISH檢查結果陽性4例，1例復發(低級別)者的M-FISH檢查結果為陽性。膀胱鏡檢查結果為可疑12例，其中M-FISH檢查結果陽性2例，4例復發(低級別2例、高級別2例)者的M-FISH檢查結果陽性1例(低級別)、陰性3例(高級別)。膀胱鏡檢查結果陽性10例，其中M-FISH檢查結果陽性1例，9例復發(低級別5例、高級別4例)者的M-FISH檢查結果陽性1例(高級別)、陰性8例(低級別5例、高級別3例)。膀胱鏡檢查與M-FISH檢查的陽性率比較，P＜0.05。膀胱鏡檢查結果陰性、M-FISH檢查結果為陽性預測復發的敏感性100%、特異性94.3%，陽性預測值25%，陰性預測值100%。膀胱鏡檢查結果可疑、M-FISH檢查結果為陽性預測復發的敏感性25%、特異性87.5%，陽性預測值50%，陰性預測值70%。膀胱鏡檢查結果陽性、M-FISH檢查結果為陽性預測復發的敏感性11.1%、特異性100%，陽性預測值100%，陰性預測值11.1%。

3 討論

目前，尿脫落細胞學檢查與膀胱鏡檢查作為膀胱尿路上皮癌術后的主要隨訪項目，但尿脫落細胞學檢查對低級別尿路上皮癌的敏感度不高，對高級別尿路上皮癌敏感度為71% ～84%［5］。本研究中，尿脫落細胞學檢查漏診了14例復發患者，效果欠佳。因M-FISH探針按照堿基互補原則，能與細胞核酸特異性結合，顯色后可被測定，能檢測出腫瘤染色體數目改變的能力，提高檢測尿路上皮癌的敏感度。但M-FISH費用昂貴，有一定假性結果。因此，評估M-FISH在膀胱癌隨訪中的價值尤為重要。

在10例膀胱鏡檢查陽性者中，9例復發，其中8例M-FISH結果為假陰性，敏感度僅為11.1%，含3例高級別尿路上皮癌。假陰性較高原因可能與患者尿脫落細胞學檢查均為陰性有關。患者的尿標本中腫瘤細胞不多，其尿脫落細胞學檢查結果為陰性，腫瘤細胞脫落或暴露不足降低了M-FISH的敏感性［6］。部分腫瘤細胞可能以二倍體的形式存在而致 FISH 假陰性［7］，且所檢測的 3、7、17 號染色體及9p21占全部染色體的少數部分，部分膀胱癌患者可能出現其他染色體異常，導致M-FISH結果假陰性。這部分膀胱鏡檢查結果陽性的復發患者可根據病理結果行二期手術治療，而不必考慮其尿脫落細胞學和M-FISH結果。在12例膀胱鏡檢查結果為可疑的患者中，M-FISH檢測的敏感度僅有25%，僅檢測出4例中的1例，漏診了3例高級別癌。原因可能是部分膀胱腫瘤為嵌頓型，表面存在未受損的膀胱黏膜，阻礙腫瘤細胞脫落，從而導致脫落細胞學檢查和M-FISH檢測陰性［8］。在54例膀胱鏡檢查陰性患者中，復發的僅1例低級別癌，其M-FISH結果陽性。原因可能為低級別腫瘤出現細胞學異常時，其形態學尚未出現異常［9］。雖然M-FISH敏感度為100%，但膀胱鏡檢查及尿脫落細胞學均為陰性的膀胱癌患者復發率低［7］，考慮到M-FISH檢查的高昂費用，可認為M-FISH在這部分病例中經濟效益低。

本研究在隨訪過程中，M-FISH僅檢測出3例膀胱癌，漏診11例(14.5%)，檢出率不高。考慮到MFISH技術尚不完善，且對技術條件和器械有一定要求，使用的探針費用較高，還存在一定漏診率，膀胱癌患者可不考慮將M-FISH檢測作為隨訪的常規監測項目。研究［10］表明，如果尿脫落細胞學檢查和膀胱鏡檢查均為陰性的膀胱癌患者，尤其是低級別膀胱癌，可延長隨訪間期。對尿脫落細胞學及M-FISH檢查結果均陰性患者，亦可延長隨訪間期［8］，研究［11，12］發現，M-FISH 陽性常在膀胱鏡檢出現異常前6個月。

M-FISH雖已取得較大進展，但M-FISH檢測費用昂貴，并未被臨床指南推薦作為膀胱癌的常規檢查項目［13］。雖然尿脫落細胞學檢查敏感性不如MFISH，但因其廉價、無創、高特異性等特點［14］，其隨訪作用尚不能被M-FISH替代。建議對膀胱鏡檢查和尿脫落細胞學檢查均為陰性的病例限制使用MFISH檢測。

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