超順磁性氧化鐵納米顆粒的理化性質及其標記BMSCs的安全性、示蹤時效性研究進展

王海龍，張良，郭艾

(首都醫科大學附屬北京友誼醫院，北京100050)

骨髓間充質干細胞(BMSCs)是良好的組織工程載體細胞［1，2］，在組織損傷的修復與重建方面起重要作用［3］。隨著干細胞移植技術的深入發展，動態監測移植后移植細胞的分化和生存狀態，了解干細胞移植的治療機制，評估移植效果等問題成為下一步研究工作的重點。自1999年提出了分子影像學(MI)概念［4］后，應用磁共振(MR)對比劑標記細胞已有10余年的歷史，上個世紀90年代末就已經提出“納米醫學”概念。近年來，超順磁性氧化鐵納米顆粒(SPIONs)標記干細胞的技術已被用于細胞MR活體示蹤和細胞磁靶向研究，成為探索細胞移植機制和改善療效的有力工具。本文就SPIONs的理化性質及其標記BMSCs的安全性、示蹤時效性研究進展作一綜述。

1 SPIONs相關理化性質

SPIONs的基本結構多是以葡聚糖包裹氧化鐵顆粒而得，直徑在納米數量級，粒度的大小將影響其在體內分布的特異性和磁化特性。根據粒度的大小，超順磁性氧化鐵(SPIO)可分為普通型SPIO(直徑40～400 nm)和超微型SPIO(USPIO，最大直徑＜30 nm)兩類。Feridex@是SPIO類造影劑的典型代表，而Combidex@是USPIO類造影劑的典型代表。

1.1 磁性納米晶體的合成 目前，臨床用商品化的磁性納米顆粒均采用共沉淀法制備。共沉淀法的原理是通過化學計量比的二價和三價鐵離子在特定pH值及穩定劑存在的情況下，通過水解、陳化反應來實現磁性氧化鐵納米顆粒的制備;之后，應用高溫熱分解制備技術，使磁性氧化鐵納米顆粒結晶度更高、磁響應性更強，納米晶體的單分散性更好，表面修飾結構更清晰［5，6］。

1.2 SPIONs的表面化學修飾 由于SPIO與細胞膜均帶負電，未經修飾無法有效標記BMSCs;同時，為了提高其穩定性、預防顆粒間的聚集、保證生理條件下的無毒狀態及增強其靶向功能，在這些顆粒表面涂以合適的分子材料進行表面修飾是必要的。目前，多采用帶正電荷的轉染劑如多聚賴氨酸、硫酸魚精蛋白、繁枝體等通過靜電包裹鐵顆粒，使帶負電的細胞通過非特異性膜表面吸收過程攝取鐵顆粒進入細胞內。陳鵬等［7］采用無葡聚糖包被超順磁性氧化鐵納米顆粒標記大鼠骨髓間充質干細胞，50 mg/L質量濃度的無葡聚糖包被SPIONs可100%標記細胞，且細胞毒性及對細胞增殖活性的影響較小。李冰玉等［8］采用SPIONs鐵羧葡胺(SHU 555A，商品名為Resovist)標記大鼠BMSCs，50 mg/L質量濃度的Resovist普魯士藍染色顯示，細胞內均可見大量著色顆粒，標記率接近100%;電鏡檢查顯示，胞質內有含鐵致密顆粒囊泡，未見氧化鐵對細胞微細結構的破壞和毒性作用;原子吸收分光光度法測定結果顯示，細胞平均鐵含量30 pg。Resovist標記和外加磁場對細胞增殖能力、細胞活力均無明顯影響。胡豐等［9］用葉酸偶聯的超順磁Fe3O4納米顆粒，不僅細胞毒性小，而且通過其表面的葉酸與葉酸受體的高強結合作用被高效介導進入腫瘤細胞內，增強MR成像(MRI)中腫瘤組織與周圍正常組織的對比度，有利于腫瘤細胞的標記、示蹤和靶向檢測，是一種很有應用前景的腫瘤細胞靶向檢測物質。

2 SPIONs標記BMSCs的安全性

大量實驗研究表明，SPIONs是存在毒性的，認為靶位點的鐵過量是產生相關毒性的原因之一。包衣離解后，靶位點高濃度的裸露氧化鐵納米顆粒會造成內穩態失衡。這將引起一系列細胞應答，進而導致DNA損害、炎性反應、氧化應激、基因突變、細胞骨架破壞等細胞毒性。SPIONs在細胞內化過程中可被溶菌酶溶解，從而釋放出游離鐵。這些游離的二價鐵離子可與線粒體內的過氧化氫或氧氣相互作用產生游離的反應性自由基，進而產生基因毒性［10］。另外，SPIONs也會因劑量的增大影響免疫功能［11］。Mahmoudi等［12］研究表明，SPIONs 因使被標記的細胞離子平衡和蛋白功能局部形成了氣體囊泡，是其產生毒性的主要原因。同時，越來越多的證據表明，顆粒的理化特性在其毒性方面起了重要作用，主要影響因素包括顆粒的大小、形狀、純度以及表面所帶電荷等。顆粒越小越易進入細胞，與細胞內成分相互作用從而影響細胞的功能;有研究表明，球形顆粒更易被細胞攝取;納米材料制作過程中的金屬殘留污能引起細胞毒性反應［13］。但大量實驗研究也表明，在適當濃度下，SPIONs標記BMSCs對細胞的生物學特性無明顯影響［14］。多篇文獻報道，當SPIONs標記移植細胞的培養液濃度為25～50 mg Fe/L時，可有效標記細胞(標記率可達99%)，且對細胞的活力、生長、分化、功能以及其他生物活性均無不利影響，也無毒性［15］。張瑞平等［16］總結前人的研究結果得出20～50 mg Fe/L為安全而又有效的標記濃度，低于20 mg Fe/L培養液則無法有效標記或需增加標記后的孵育時間，而高于50 mg Fe/L培養液將使細胞的生物學活性受到不同程度的抑制。Struys等［17］研究認為，SPIONs有效標記干細胞的最低質量濃度為15 mg Fe/L。

3 SPIONs標記BMSCs的MR示蹤時效性

Ittrich等［18］實驗證實，細胞對鐵顆粒的吸收與氧化鐵和細胞的濃度均呈正相關。細胞內鐵顆粒越多，MRI會更明顯;但細胞內過多的鐵又會對細胞產生毒性，影響其增殖、分化能力，從而影響活體成像的追蹤觀察。顏榮華等［19］用Fe3O4@CdTe@SiO2納米顆粒標記大鼠BMSCs實驗證實，標記組3×106至5×104個細胞的T2WI、T2*WI信號明顯減低，以3×106最顯著;隨著細胞數量級的減小，信號逐漸縮小，數量級 ＜1×104幾乎不能被檢測到。Kraitchman等［20］利用SPIONs標記BMSCs經導管注入犬心肌梗死模型周邊區域，術后持續8周，1.5 T MRI仍可明確觀察到移植部位發出1條低信號。Jin等［21］將SPIONs標記的兔BMSCs注射到兔膝關節關節軟骨缺損模型中，在隨后的12周內MRI檢測都觀察到兔膝關節內的信號減低區，病理切片證實損傷軟骨內可觀察到標記的干細胞。顧玉梅等［22］將SPIONs作為示蹤劑在MR下對移植入大鼠梗死邊緣區的BMSCs進行體內追蹤，SPIONs標記MSCs陽性率達95%，對MSCs的活性和分化無明顯影響。磁性細胞移植組術后3、7、14 d在MR T2像顯示的低信號注射點依次減少，術后21 d不能顯示注射點;并隨時間的延長，低信號區域邊界模糊，范圍擴大，信號對比度降低。孟增東等［23］觀察移植入股骨頭壞死區的 SPIONs標記的 BMSCs在 SE T2WI、FSE T2WI、GRE T2WI 3 種掃描序列中信號變化情況，移植后4周行MRI掃描，標記組的低信號區均明顯減弱，移植后6周已難分別出低信號區;同時，移植后6周觀察到標記細胞移植側低信號區面積漸增大，表明SPIONs標記的BMSCs移植后在股骨頭壞死區的遷徙、擴散。

隨著干細胞移植醫學的發展，對干細胞活體示蹤技術方法的研究愈加迫切。SPIONs的物理特性、標記干細胞的機制，以及標記后對干細胞的影響已有大量實驗研究，但目前還主要進展到體外研究和動物實驗階段。干細胞在體內如何參與修復過程、如何向成骨或成血管方向分化，是有待解決的重要問題;如何提高活體示蹤物在體內的觀察對比度，以及如何延長示蹤物在體內的觀察時間等問題仍待進一步研究。

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