肝癌組織中HuR和HIF-1α的表達及其相關性

劉利平，江建新，鮑世韻，張育森，何婉(暨南大學第二臨床醫學院，深圳市人民醫院，廣東深圳5800;湖北省腫瘤醫院)

肝癌組織中HuR和HIF-1α的表達及其相關性

劉利平1，江建新2，鮑世韻1，張育森1，何婉1
(1暨南大學第二臨床醫學院，深圳市人民醫院，廣東深圳518020;2湖北省腫瘤醫院)

摘要:目的觀察人抗原R(HuR)和缺氧誘導因子(HIF) -1α在肝癌組織中的表達變化，并探討其相關性。方法取48例肝癌組織及癌旁組織標本，采用免疫組化染色法檢測肝癌組織及癌旁組織中HuR和HIF-1α蛋白的表達，采用熒光定量PCR法檢測肝癌組織中HIF-1α mRNA的表達。結果肝癌組織中HuR和HIF-1α蛋白陽性表達率分別為67%和58%，顯著高于癌旁組織的19%和10% (P均＜0.01)。肝癌組織中HuR與HIF-1α蛋白的表達呈正相關(r=0.723，P＜0.01)。HuR蛋白高表達者中HIF-1α mRNA的表達較HuR蛋白低表達者顯著上調(P ＜0.05)。結論肝癌組織中HuR和HIF-1α蛋白表達上調且呈正相關關系，HuR可能增強HIF-1α mRNA的穩定性，從而促進其表達。

關鍵詞:肝癌;人抗原R;缺氧誘導因子-1α; RNA結合蛋白

實體瘤在生長過程中，由于腫瘤細胞增殖過快和新生血管功能缺陷，常常造成局部組織微環境缺氧。缺氧誘導因子(HIF) -1α是介導腫瘤適應缺氧狀態的重要轉錄因子［1］，在缺氧狀態下可轉運至細胞核內，與HIF-1β結合成為有活性的HIF-1復合物，再與下游靶基因的缺氧反應元件(HRE)結合，啟動下游靶基因的轉錄，促進腫瘤細胞生長、侵襲、轉移和化療耐藥［1，2］。然而缺氧狀態下細胞內基因轉錄常常受到抑制，蛋白翻譯也通常受阻。人抗原R(HuR)為RNA結合蛋白，可通過與靶基因末端富含腺嘌呤和尿嘧啶的序列結合，增強mRNA的穩定性和調節蛋白翻譯［2，3］。因此，HIF-1α和HuR分別在轉錄水平和轉錄后水平調節腫瘤細胞對缺氧的適應性。本研究對肝癌組織中HIF-1α和HuR蛋白表達情況進行檢測，分析二者的相關性。現報告如下。

1　資料與方法

1.1臨床資料選擇深圳市人民醫院2013～2014年行手術切除的肝癌患者48例，男46例、女2例，年齡31～65歲、平均49.5歲。其中乙肝表面抗原陽性35例。患者術前均未接受化療、放療及免疫治療。取手術切除的肝癌組織及對應的癌旁組織(距腫瘤邊緣2 cm以上)各48例份，液氮中保存備用。標本經10%甲醛固定，常規脫水、石蠟包埋。所有標本均經病理組織學檢查證實。

1.2檢測指標

1.2.1HuR和HIF-1α蛋白檢測采用免疫組化法。將石蠟切片脫蠟至水，3% H2O2室溫孵育15 min滅活內源性過氧化物酶，微波抗原修復，滴加10%山羊血清37℃封閉1 h。棄封閉液，加入100 μL鼠抗人HuR單克隆抗體(1∶200稀釋)，4℃過夜。依次滴加生物素化二抗、親和素(試劑A)、辣根過氧化物酶(HRP)標記的親和素(試劑B)，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木素復染，脫水、透明、封片。顯微鏡下觀察染色結果，以PBS代替一抗做為陰性對照。HuR陽性表達為細胞核染棕黃色，HIF-1α陽性表達為細胞核和(或)細胞質染棕色。結果判定采用半定量計分法，根據陽性細胞染色強度和陽性細胞率乘積來判定。染色強度評分標準:無特異染色為0分，輕度染色為1分，中度染色為2分，強染色為3分;陽性細胞率評分標準:無為0分，1%～25% 為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。兩項乘積等于0～4分為低表達，5～12分為高表達。

1.2.2HIF-1α mRNA檢測采用Real-time PCR法。取約2 mm3大小的腫瘤組織，加入TRIZol液提取細胞總RNA，取1 μg逆轉錄為cDNA。采用Premier Primer 5軟件設計基因引物，HIF-1α引物上游5'-ACTTCTGGATGCTGGTGATTTG-3'，下游5'-GCTTCGCTGTGTGTTTTGTTCT-3';β-actin引物上游5'-GTCCACCGCAAATGCTTCTA-3'，下游5'-TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3'。將cDNA稀釋10倍，向每個PCR反應孔中加入1 μL，并加入10 nmol的上、下游引物各0.5 μL，無核酸酶的超凈水8 μL和SYBR Green Supermix 10 μL。PCR反應在ABI 7900HT熒光定量PCR檢測系統上運行，程序設置為: 95℃2 min; 95℃10 s，60℃60 s，循環40次; 72℃延伸10 min。擴增完畢后進行熔解曲線分析。實驗重復3次，采用2－ΔΔCt計算相對mRNA表達。

1.3統計學方法采用SPSS13.0統計軟件，計量資料用珋x±s表示，組間比較采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗或Fisher確切概率法，非正態分布資料采用Mann-Whitney檢驗，相關性分析采用Spearman相關檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1肝癌組織和癌旁組織中HuR和HIF-1α蛋白表達HuR蛋白在肝癌中的表達主要定位于細胞核，為粗細不一的棕褐色顆粒，并有明顯的異質性。肝癌組織和癌旁組織中的HuR蛋白陽性表達率分別為67%(32/48)和19%(9/48)，二者比較差異有統計學意義(P＜0.01)。HIF-1α蛋白在肝癌中的表達主要定位于胞質中，部分細胞核也有表達，呈棕黃色彌漫性分布。肝癌和癌旁組織中的HIF-1α蛋白陽性表達率分別為58% (28/48)和10% (5/48)，二者比較差異有統計學意義(P＜0.01)。

2.2肝癌組織中HuR蛋白與HIF-1α蛋白表達的相關性48例肝癌組織標本中，HuR和HIF-1α均低表達14例，均高表達25例。同一標本中以HIF-1α表達陽性細胞染色強度和陽性細胞率乘積評分為橫坐標，HuR表達評分為縱坐標，制成散點圖，見圖1。由圖1可見，肝癌組織中的HuR與HIF-1α表達呈正相關(r=0.723，P＜0.01)。

2.3肝癌組織中HuR蛋白表達與HIF-1α mRNA的關系將肝癌組織根據HuR表達的高低分為兩組，HuR高表達組HIF-1α mRNA表達為7.96± 1.79，HuR低表達組為3.55±1.26，兩組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。

3　討論

HuR蛋白是胚胎致死異常視覺基因家族中最重要的RNA結合蛋白，可通過與靶基因末端富含腺嘌呤和尿嘧啶的序列結合，增強mRNA的穩定性并調控其蛋白翻譯。HuR在多種正常組織中都有表達，主要分布于細胞核，在炎性因子、缺氧等因素的刺激下表達增高［3，4］。HuR在膀胱癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌及結腸癌等惡性腫瘤中的表達較正常組織明顯升高，并與患者預后相關［5～7］。本研究發現，HuR蛋白在肝癌組織中的表達較癌旁組織中顯著增高，提示HuR可能與肝癌的發生關系密切。HuR通過與其靶基因(如c-myc、P53、Cyclin D1、Cyclin A、survivin、Bcl-2、COX-2、TNF-α、VEGF、MMP-9)結合，調控癌基因、細胞周期、細胞凋亡、炎癥因子、侵襲轉移等相關分子，在腫瘤發生及惡性轉化等方面發揮重要作用［8，9］。

HuR蛋白的表達受多方面因素的調控。NF-κB、Smad轉錄因子可與HuR啟動子結合促進其轉錄，在轉錄水平上調HuR mRNA的表達。然而miR-9、miR-16、miR-34a、miR-125a和miR-519等微小RNA可與HuR的3'-末端翻譯區結合，下調HuR蛋白及mRNA的表達［9］。本研究發現，HuR與HIF-1α蛋白在肝癌組織中的表達呈正相關關系，HIF-1α在腫瘤組織中的表達高低通常反映缺氧程度，提示缺氧可能是刺激HuR表達的重要因素。在缺氧狀態下，HIF-1α與HIF-1β結合成為有活性的HIF-1復合物，與受其調節的下游靶基因HRE結合，形成轉錄起始復合物，啟動下游靶基因的轉錄［1］。HIF-1α能否通過與HuR啟動子結合促進其基因轉錄和蛋白表達還有待進一步研究。

HIF-1α的表達與缺氧密切相關，在缺氧狀態下泛素化蛋白水解酶受抑制，HIF-1α蛋白降解減少，從而表達增加［1］。然而在缺氧狀態下細胞整體轉錄水平下降，因此HIF-1α mRNA的表達應該受到抑制［3］。研究表明，HuR蛋白可以增強細胞內mRNA的穩定性。為明確HIF-1α mRNA與HuR蛋白表達的關系，我們將肝癌組織根據HuR表達的高低分為兩組，結果顯示，HuR高表達組HIF-1α mRNA表達較低表達組明顯增高，提示HuR蛋白可能在mRNA水平調節HIF-1α的表達。研究證實，HIF-1α mRNA 的3'-和5'-末端翻譯區攜帶有多個ARE［8］。因此，雖然缺氧導致HIF-1α基因轉錄受到抑制，但是HuR可能增加HIF-1α mRNA的穩定性，從而上調HIF-1α蛋白的表達。同時，在CoCl2模擬缺氧條件下，HuR還可以促進HIF-1α蛋白翻譯［8］。因此，HuR蛋白在肝癌組織中可以通過多種機制上調HIF-1α的表達。

綜上所述，HuR和HIF-1α蛋白在肝癌組織中表達明顯上調，且兩者表達呈正相關關系。HuR可能通過穩定HIF-1α mRNA和促進其翻譯，從而上調HIF-1α的表達。

參考文獻:

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Expression and correlation of HuR and HIF-1α in hepatocellular carcinoma

LIU Li-ping1，JIANG Jian-xin，BAO Shi-yun，ZHANG Yu-sen，HE Wan
(1 The Second Clinical Medical College of Jinan University，Shenzhen People's Hospital，Shenzhen 518020，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the expression and correlation of human antigen R (HuR) and hypoxia-inducible factor (HIF) -1α in hepatocellular carcinoma (HCC) tissues.Methods Forty-eight cases of HCC tissue and adjacent tissue samples were collected from patients undergoing surgical resection.The expression of HuR and HIF-1α protein in the HCC and adjacent tissues was detected by immunohistochemical staining.The mRNA expression of HIF-1α in the HCC tissues was detected by fluorescent quantitative PCR.Results The positive expression rates of HuR and HIF-1α protein in the HCC tissues were 67% and 58%，respectively.These rates were significantly higher than the positive expression rates of HuR and HIF-1α protein (19% and 10 %) in the adjacent tissues (all P＜0.01).The expression of HuR protein was positively correlated with the expression of HIF-1α protein in the HCC tissues (r=0.723，P＜0.01).The mRNA expression of HIF-1α mRNA in the group with high expression of HuR protein was significantly up-regulated as compared with that of the group with low expression of HuR protein (P＜0.05).Conclusions The expression of HuR and HIF-1α protein was up-regulated and positively correlated with each other in the HCC tissues.HuR may enhance the stability of HIF-1α mRNA，and thus increase the expression of HIF-1α protein.

Key words:liver carcinoma; human antigen R; hypoxia-inducible factor-1α;RNA-binding protein

(收稿日期:2015-02-03)

通信作者簡介:何婉(1978-)，女，主治醫師，研究方向為腫瘤基礎與臨床。E-mail: hewanshenzhen@ hotmail.com

作者簡介:第一劉利平(1982-)，男，主治醫師，研究方向為肝癌基礎與臨床。E-mail: leoliping@ aliyun.com

基金項目:國家自然科學基金資助項目(81402041、81160311)。

文章編號:1002-266X(2015) 18-0007-03

文獻標志碼:A

中圖分類號:R735.7

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.18.003