阻斷RAAS不同環節對肝纖維化大鼠ACE2、AngⅡ、Ang 1-7的影響

張曉梅，焦占江，殷鵬，丁國善，周杰，崔忠林，錢建平，曾德華(第二軍醫大學長征醫院器官移植研究所，上海0000;南方醫科大學南方醫院; 南京軍區福州總醫院)

阻斷RAAS不同環節對肝纖維化大鼠ACE2、AngⅡ、Ang 1-7的影響

張曉梅1，焦占江2，殷鵬1，丁國善1，周杰2，崔忠林2，錢建平2，曾德華3
(1第二軍醫大學長征醫院器官移植研究所，上海200003;2南方醫科大學南方醫院; 3南京軍區福州總醫院)

摘要:目的觀察阻斷腎素—血管緊張素—醛固酮系統(RAAS)不同環節對實驗性肝纖維化大鼠肝組織纖維化程度的影響并探討其作用機制。方法取6周齡SD大鼠50只，隨機分為正常對照組、模型組、卡托普利組、氯沙坦組和螺內酯組各10只。正常對照組皮下注射橄欖油，其他組給予40% CCL4腹壁皮下注射制備肝纖維化模型;自次日起，卡托普利組、氯沙坦組、螺內酯組分別經胃管內灌注ACE抑制劑卡托普利、血管緊張素(Ang)Ⅱ的Ⅰ型受體阻斷劑氯沙坦、醛固酮受體拮抗劑螺內酯，模型組和正常對照組灌注等量生理鹽水。各組動物均于第8周處死，取肝組織行HE染色和Masson染色，觀察其病理變化。ELISA法測定血清與肝組織中ACE2、AngⅡ、Ang 1-7。結果卡托普利組、氯沙坦組和螺內酯組肝纖維化程度較模型組明顯好轉;模型組、卡托普利組、氯沙坦組、螺內酯組的血清及肝組織中ACE2、AngⅡ、Ang 1-7水平均高于正常對照組，卡托普利組、氯沙坦組、螺內酯組的ACE2及Ang 1-7水平均高于模型組、AngⅡ水平低于模型組(P均＜0.05) ;氯沙坦組、螺內酯組的ACE2、AngⅡ、Ang 1-7水平與卡托普利組相比差異無統計學意義。結論阻斷RAAS不同環節均可抑制肝纖維化形成，其機制可能是通過升高血清及肝組織中ACE2、Ang 1-7水平、降低AngⅡ水平來發揮抗肝纖維化的作用。

關鍵詞:腎素—血管緊張素—醛固酮系統;肝纖維化;血管緊張素Ⅱ;血管緊張素1-7

肝纖維化是諸多肝病共同的病理改變。腎素—血管緊張素—醛固酮系統(RAAS)為一內分泌系統，具有廣泛的生物學效應，作用于全身多個器官。除了循環系統中存在RAAS，許多器官如心、腎、肺、胰腺和肝臟都存在局部或器官內的RAAS［1］。研究表明，肝臟局部的RAAS參與肝纖維化的發展［2］。2012～2015年，我們對肝纖維化大鼠模型胃管灌注血管緊張素轉換酶(ACE)抑制劑卡托普利、血管緊張素(Ang)Ⅱ的Ⅰ型受體阻斷劑氯沙坦、醛固酮受體拮抗劑螺內酯，觀察其對血清及肝組織中ACE2、AngⅡ、Ang 1-7水平的影響，探討阻斷RAAS不同環節抗肝纖維化的實驗依據。

1　材料與方法

1.1材料6周齡清潔級SD大鼠(福建醫科大學動物實驗中心提供) 50只，雌雄不拘，體質量180～220 g，室溫18～25℃，濕度30%～50%，精制飼料喂養。氯沙坦鉀片(杭州默沙東制藥有限公司)，卡托普利片(湖南湘雅制藥有限公司)，螺內酯片(杭州民生藥業集團有限公司產品)。ACE2、AngⅡ、Ang 1-7酶聯免疫測定試劑盒均購自美國mybiosource公司。

1.2分組與給藥方法將大鼠隨機分為正常對照組、模型組、卡托普利組、螺內酯組和氯沙坦組，每組各10只。正常對照組皮下注射橄欖油，余均予以40% CCL4腹壁皮下注射，3 mL/kg，首劑加倍，1次/3 d，復制大鼠肝纖維化模型;次日起，卡托普利組、氯沙坦組、螺內酯組胃管內分別灌注卡托普利60 mg/kg、氯沙坦10 mg/kg、螺內酯100 mg/kg，模型組和正常對照組灌注等量生理鹽水，均1次/d。各組動物均于第8周處死，取肝臟相同部位的組織，液氮保存，且在大鼠處死前于大鼠尾靜脈取血。

1.3觀察指標①一般情況:觀察大鼠體質量、精神、飲食、活動、死亡等情況。②肝組織病理檢查及纖維化評分:肝臟組織染色后在光鏡下觀察其病理變化。參照肝纖維化半定量計分系統(SSS)對大鼠肝纖維化進行評分［3］。對大鼠肝組織切片進行Masson染色，每張切片選取四周及中央區域膠原纖維含量最多的視野，采集圖像后應用HIPAS-2000型計算機圖像分析系統進行圖像處理，計算著色面積和總面積，于100倍鏡下測定膠原纖維面積，以膠原纖維面積/肝組織面積×100%計算膠原纖維面積百分比。③血清及肝組織中ACE2、AngⅡ、Ang 1-7檢測:采用ELISA法測定，嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行操作。取出凍存血清及肝組織勻漿后的上清液，室溫溶解。嚴格按照說明書配制標準品，逐一梯度稀釋，最后的一管作為空白對照，加入標準品和待測樣品，均設復孔，每孔100 μL，震蕩混勻。37℃反應120 min。洗滌，依次加入一抗、酶標抗體、底物工作液100 μL，混合均勻，37℃反應30 min。加入終止液100 μL終止反應。用酶標儀在450 nm處測定吸光度(OD)值。計算濃度:所有OD值減去空白值后再計算，以標準品為橫坐標，對應的OD值為縱坐標，畫出標準曲線，根據所測樣品對應的OD值，在標準曲線上查出相應的濃度(樣本被稀釋后的，還應乘以稀釋的倍數)。

1.4統計學方法采用SPSS11.0統計軟件，計量資料以珋x±s表示，多組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組一般情況各組均無大鼠死亡。正常對照組精神良好，毛色光澤，運動活潑，反應敏銳，進食、飲水正常，體質量增加;模型組精神萎靡，活動少，反應遲鈍，進食、飲水少，體質量下降明顯;卡托普利組、螺內酯組和氯沙坦組精神、活動、反應、飲食、體質量均較模型組好。

2.2各組肝組織病理檢查結果HE染色顯示，正常組肝細胞以中央靜脈為中心向周圍呈放射狀排列，結構完整。模型組肝細胞索排列紊亂，肝細胞呈彌漫性脂肪變性，空泡形成，匯管區擴大，匯管區和肝小葉內可見淋巴細胞浸潤，假小葉形成。卡托普利組、氯沙坦組、螺內酯組見肝細胞壞死及空泡變性減少，淋巴細胞浸潤減少。Masson染色可見正常組膠原纖維在血管周圍少量表達，模型組膠原纖維增生明顯，纖維間隔形成，可見弓形纖維，部分區域形成假小葉，卡托普利組、氯沙坦組、螺內酯組膠原纖維減少，形成的纖維間隔和假小葉明顯減少。

2.3各組肝纖維化SSS評分正常對照組、卡托普利組、氯沙坦組、螺內酯組肝纖維化評分分別為(0.53±0.15)、(7.05±0.26)、(7.15±0.11)、(6.68±0.31)分，均低于模型組的(19.40±0.87)分(P均＜0.05)，卡托普利組、氯沙坦組、螺內酯組均高于正常對照組(P均＜0.05)，氯沙坦組、螺內酯組、卡托普利組間比較差異無統計學意義。

2.4各組膠原纖維面積百分比正常對照組、卡托普利組、氯沙坦組、螺內酯組膠原纖維面積百分比分別為(0.71±0.04) %、(9.95±0.57) %、(11.18± 0.62) %、(11.53±0.55) %，均低于模型組的(23.70 ±1.87) %，P均＜0.05，卡托普利組、氯沙坦組、螺內酯組均高于正常對照組(P均＜0.05)，氯沙坦組、螺內酯組與卡托普利組比較差異無統計學意義。

2.5各組血清及肝組織中ACE2、AngⅡ和Ang 1-7水平見表1。

表1　各組血清及肝組織中ACE2、AngⅡ和Ang 1-7水平比較(ng/mL，±s)

注:與正常對照組比較，*P＜0.05;與模型組比較，△P＜0.05。

組別　n ACE2血清　肝組織Ang Ⅱ血清　肝組織Ang 1-7血清　肝組織正常對照組　10　6.30±0.24　7.30±0.30　0.10±0.01　0.23±0.03　0.11±0.01　0.30±0.02模型組　10　13.70±0.57*　14.90±0.48*　0.40±0.03*　0.76±0.03*　0.80±0.02*　0.89±0.02*卡托普利組　10　27.00±0.73＊△　23.30±0.79＊△　0.20±0.02＊△　0.40±0.02＊△　1.49±0.08＊△　1.57±0.28＊△氯沙坦組　10　28.50±1.23＊△　24.30±0.45＊△　0.17±0.02＊△　0.37±0.03＊△　1.32±0.02＊△　1.52±0.35＊△螺內酯組　10　28.40±1.03＊△　24.50±0.42＊△　0.16±0.01＊△　0.42±0.03＊△　1.35±0.03＊△　1.50±0.03＊△

3　討論

肝纖維化是由于多種病因(如病毒、乙醇、寄生蟲、銅鐵沉積等)引起慢性肝損傷，最終導致以膠原為主的細胞外基質(ECM)各成分合成增多，降解相對不足，過多沉積在肝內，引起肝纖維化［4，5］。肝纖維化屬可逆性病變，肝硬化則難以逆轉。肝纖維化是肝細胞肝癌的危險因素之一［5］。

RAAS在慢性肝損傷、肝纖維化中起重要作用。除了循環系統中存在RAAS外，肝臟局部的RAAS也參與了肝纖維化的發展，并在肝纖維化的形成及發展過程中起重要作用。以往認為，RAAS作用軸ACE-AngⅡ-AT1受體軸是生物關聯性的惟一體系，具有促進肝纖維形成的作用。ACE2-Ang 1-7-Mas受體軸是新發現的RAAS作用軸，對肝纖維化的發生具有保護作用［6］，被認為是ACE-AngⅡ-AT1受體軸的反向調節軸［7］。ACE2在RAAS中的作用與ACE相反，被認為是RAAS的一個負性拮抗劑。

ACE2是通過克隆技術從心衰患者和淋巴癌cDNA庫中克隆出來的人類ACE相關羧肽酶［8，9］，定位于X染色體的Xp22位點。人類ACE2分子量約為120 kD，由805個氨基酸組成，是Ⅰ型膜結合糖蛋白，其結構包括一個由17個氨基酸組成的N末端信號肽區、一個錨定在細胞膜C末端的跨膜區和一個與ACE活性位點相一致的單一HExXH鋅結合區。人與嚙齒動物的ACE2是結構相似的蛋白質，小鼠與人的ACE2有83%的同源性，ACE與ACE2的金屬蛋白酶催化區有42%是一致的［10］。ACE2被認為是慢性肝損傷的負調節劑［11］，對ACE具有拮抗作用。研究表明，RAAS的主要作用成分AngⅡ具有促纖維化的作用［12］，可誘導肝臟星形細胞收縮和增殖，這是肝腺泡纖維化的主要因素［10～14］。隨著肝纖維化的進展，AngⅡ在肝臟中的表達逐漸增多［15］。研究表明，ACE裂解AngⅠ生成AngⅡ，ACE2可裂解AngⅠ和AngⅡ，分別生成Ang 1-9和Ang 1-7，而Ang 1-9可被ACE裂解，生成Ang 1-7。Ang 1-7對AngⅡ介導的肝臟纖維化具有保護作用［16］。研究證實，Ang 1-7能夠減輕肝纖維化的程度，同時減少羥脯氨酸及膠原1A1、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、血管內皮生長因子(VEGH)、結締組織生長因子(CTGF)、ACE及Mas受體的基因表達［17］。亦有研究表明，ACE2可裂解AngⅡ，增加Ang 1-7的生成，在膽管結扎肝纖維化大鼠中表現出抗肝纖維化的作用［18］。

本研究對循環中的ACE2、AngⅡ、Ang 1-7水平進行檢測，結果表明，模型組、卡托普利組、氯沙坦組、螺內酯組的ACE2、AngⅡ、Ang 1-7水平均高于正常對照組;卡托普利組、氯沙坦組、螺內酯組的ACE2及Ang 1-7水平均高于模型組、AngⅡ水平低于模型組;氯沙坦組、螺內酯組的ACE2、AngⅡ、Ang 1-7水平與卡托普利組相比差異無統計學意義。提示循環中的ACE2、Ang 1-7、AngⅡ均參與了肝纖維化的形成和發展，肝纖維化形成及發展中ACE2、Ang 1-7、AngⅡ水平均升高，而采用ACE抑制劑卡托普利、AngⅡ受體阻滯劑氯沙坦、醛固酮受體拮抗劑螺內酯分別作用于RAAS的不同環節可以提高循環中ACE2、Ang 1-7水平，降低AngⅡ水平，從而起到抗肝纖維化的作用。

肝臟局部RAAS亦參與肝纖維化的形成及發

展。本研究對肝臟組織中的ACE2、AngⅡ、Ang 1-7水平進行檢測，結果表明，模型組、卡托普利組、氯沙坦組、螺內酯組的ACE2、AngⅡ、Ang 1-7水平亦均高于正常對照組;卡托普利組、氯沙坦組、螺內酯組的ACE2及Ang 1-7水平亦均高于模型組、AngⅡ水平低于模型組;氯沙坦組、螺內酯組的ACE2、AngⅡ、Ang 1-7水平與卡托普利組相比差異無統計學意義。提示肝組織中的ACE2、Ang 1-7、AngⅡ均參與了肝纖維化的形成和發展，肝纖維化組織中，ACE2、Ang 1-7、AngⅡ水平均升高，采用ACE抑制劑卡托普利、AngⅡⅡ受體阻滯劑氯沙坦、醛固酮受體拮抗劑螺內酯分別作用于RAAS的不同環節可以提高肝組織中ACE2、Ang 1-7水平，降低AngⅡ水平，從而起到抗肝纖維化的作用。

綜上所述，循環及肝臟組織中的AngⅡ在肝纖維化形成和發展中起著促肝纖維化發生發展的作用，而ACE2、Ang 1-7在肝纖維化形成和發展中具有重要的調控作用。干預RAAS不同的環節拮抗肝纖維化，可能是通過升高循環及肝臟組織中的ACE2、Ang 1-7、降低循環及肝臟組織中的AngⅡ來發揮抗肝纖維化的作用。

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Effects of local blockage of RAAS at different levels on expression of ACE2，AngⅡand Ang 1-7 in rats with hepatic fibrosis

ZHANG Xiao-mei1，JIAO Zhan-jiang，YIN Peng，DING Guo-shan，ZHOU Jie，CUI Zhong-lin，QIAN Jian-ping，ZENG De-hua
(1 PLA Institution of Organ Transplantation，Changzheng Hospital，Second Military Medical University，Shanghai 200003，China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effects of local blockage of renin-angiotensin-aldosterone system (RAAS) on the degrees of fibrosis and to investigate its mechanism in liver tissues of experimental rats with hepatic fibrosis.Methods Fifty SD rats aged 6 weeks were randomly divided into five groups: the normal control group，model group，captopril group，losartan group and spironolactone group，with 10 rats in each group.In the normal control group，the rats received subcutaneous injection of olive oil，while other rats received subcutaneous injection of 40%CCL4to make the hepatic fibrosis models.The next day，rats of the three treatment groups were daily injected with captopril (captopril group)，losartan (losartan group) and spironolactone (spironolactone group).Rats in the control group and model group received the same amount of normal saline everyday.Rats in each group were sacrificed at 8 weeks.The liver tissues were obtained and stained by HE staining and Masson staining to observe the pathological changes.Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to determine the levels of ACE2，AngⅡand Ang 1-7 in the serum and liver tissues.Results The degree of liver fibrosis in the captopril group，losartan group and spironolactone group was significantly improved as compared with that of the model group; the levels of ACE2，AngⅡ，Ang 1-7 in the serum and liver tissue of the model group，captopril group，losartan group and spironolactone group were all higher than those of the normal control group; the levels of ACE2 and Ang 1-7 in the captopril group，losartan group and spironolactone group were all higher，but the AngⅡlevel was lower than that of the model group (all P＜0.05).No statistically significant differences were found in the levels ofbook=15,ebook=20ACE2，AngⅡ，and Ang 1-7 between the losartan group，spironolactone group and captopril group.ConclusionThe local blockage of RAAS at different levels may all inhibit the liver fibrosis，whose mechanism may be related with the increase of ACE2 and Ang 1-7 and the decrease of AngⅡin the serum and liver tissues.

Key words:renin-angiotensin-aldosterone system; liver fibrosis; angiotensinⅡ; angiotensin 1-7

(收稿日期:2015-01-28)

通信作者簡介:焦占江(1981-)，男，主治醫師。研究方向為肝纖維化的臨床和基礎研究E-mail: zhanjiangjiao@ yeah.net

作者簡介:第一張曉梅(1984-)，女，住院醫師。研究方向為肝移植及肝纖維化的臨床及基礎研究。E-mail: 910195473@ qq.com

基金項目:廣東省自然科學基金資助項目(S2011010003901)。

文章編號:1002-266X(2015)18-0014-04

文獻標志碼:A

中圖分類號:R575

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.18.005