mM-CSF及其剪切體對淋巴細胞白血病Ramos細胞增殖的抑制作用

馬翠花，種靖慧，廖金鳳，林永敏，衛佳，鄭國光(中國醫學科學院血液學研究所血液病醫院，天津300020;2秦皇島市第一醫院)

mM-CSF及其剪切體對淋巴細胞白血病Ramos細胞增殖的抑制作用

馬翠花1，2，種靖慧1，廖金鳳1，林永敏1，衛佳1，鄭國光1
(1中國醫學科學院血液學研究所血液病醫院，天津300020;2秦皇島市第一醫院)

摘要:目的探討膜結合型巨噬細胞集落刺激因子(mM-CSF)及其剪切體(mM-CSF-Δ)對淋巴細胞白血病Ramos細胞增殖的抑制作用。方法采用Overlap PCR法構建帶有mM-CSF的真核表達質粒pTARGET-mM-CSF，再進一步構建胞內區截短30個氨基酸的表達質粒pTARGET-mM-CSF-Δ，并進行PCR及DNA雙向測序鑒定。將空載體pTARGET、pTARGET-mM-CSF、pTARGET-mM-CSF-Δ質粒分別轉染Ramos細胞，經G418篩選穩定表達細胞株，并用RT-PCR、Western blotting進行鑒定; MTT法檢測細胞增殖，流式細胞儀檢測細胞周期。結果成功構建了mM-CSF和mM-CSF-Δ的真核表達載體，獲得了穩定轉染細胞株Ramos-V、Ramos-M和Ramos-Δ。Ramos-M、Ramos-Δ、Ramos-V細胞增殖能力的OD值分別為0.413±0.014、0.384±0.019、0.463±0.037，Ramos-M細胞與Ramos-Δ細胞比較，Ramos-M、Ramos-Δ細胞分別與Ramos-V細胞比較，P＜0.05或＜0.01。Ramos-M、Ramos-Δ、Ramos-V細胞處于G0/G1期的比例分別為41.54%±1.22%、45.60%±1.09%、39.20%±1.53%，Ramos-M細胞與Ramos-Δ細胞比較，Ramos-M、Ramos-Δ細胞分別與Ramos-V細胞比較，P＜0.05或＜0.01。結論mM-CSF、mM-CSF-Δ均能抑制淋巴細胞白血病Ramos細胞增殖，且后者抑制作用更強。

關鍵詞:白血病; Ramos細胞;巨噬細胞集落刺激因子;膜結合型巨噬細胞集落刺激因子;剪切體;細胞增殖;細胞周期

細胞因子是傳遞細胞間通信的重要載體之一，其表達、定位發生改變會引起細胞間信號的異常傳遞。除了經典的可溶性形式，許多細胞因子如TGF-α、干細胞因子等，還以膜結合形式存在，并與其受體通過并置性作用機制參與鄰近細胞之間的細胞通信［1］。巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)經選擇性剪接可產生3種異構體，即膜結合型CSF (mM-CSF)、分泌型CSF(sM-CSF)和基質型CSF (PG-M-CSF)［2］。mM-CSF作為膜結合型細胞因子，其異常表達與血液腫瘤細胞的關系備受關注。本研究旨在探討mM-CSF對淋巴細胞白血病Ramos細胞增殖的影響及其機制。

1　材料與方法

1.1主要試劑RPMI1640培養基購自Gibco公司，TRIzol、MML-V試劑和LipofectamineTM2000均購自美國Invitrogen公司。Ex Taq DNA聚合酶、T4DNA連接酶、PyrobestTMDNA聚合酶、質粒提取和膠回收試劑盒均購自TaKaRa公司，PCR擴增引物的合成與DNA測序均由上海生工公司完成，Anti-MCSF抗體購自R＆D公司，Super-Signal West Pico化學發光試劑盒購自美國Pierce公司，G418和MTT購自Sigma公司。

1.2pTARGET-mM-CSF和pTARGET-mM-CSF-Δ真核表達載體的構建用Overlap PCR方法獲得mM-CSF序列。以含有M-CSF基因的pCDNA3.0質粒(購自Santa公司)為模板，分別擴增、純化出mMCSF的兩段編碼序列mM-CSF1(Forward為5'-ACCGCTCGAGGCCCGTATGACCGCGCCG-3'，Reverse為5'-CTCATGGCCTTGGCTGGA-3';片段大小543 bp)和mM-CSF2(Forward為5'-TCCAGCCAAGGCCATGAG-3'，Reverse為5'-ACGGGGTACCCTACACTGGCAGTTCCACC-3';片段大小228 bp)，然后以它們的混合物為模板用mM-CSF的克隆引物(Forward為5'-ACCGCTCGAGGCCCGTATGACCGCGCCG-3'，Reverse為5'-ACGGGGTACCCTACACTGGCAGTTCCACC-3';片段大小771 bp)擴增出完整的mM-CSF序列。再以mM-CSF序列為模板，應用mM-CSF-Δ的克隆引物(Forward為5'-ACCGCTCGAGGCCCGTATGACCGCGCCG-3'，Reverse為5'-ACGGGGTACCCTAGCTCCTCCGCCTCCACC-3';片段大小681 bp)擴增胞內區編碼30個氨基酸的基因片段獲得mM-CSF-Δ序列。以上PCR反應步驟均如下:用高保真PyrobestTMDNA聚合酶進行PCR;94℃預變性5 min;94℃變性30 s，55℃退火40 s，72℃延伸1 min，30個循環后72℃7 min結束反應。分別膠回收帶有mM-CSF和mM-CSF-Δ序列的PCR產物，經XhoⅠ和KpnⅠ雙酶切并與pTARGET載體連接，轉化感受態E.coli DH5α，篩選陽性克隆，提取質粒，進行PCR鑒定及DNA雙向測序鑒定。PCR鑒定插入片段大小正確(圖1)，DNA測序正確。

1.3細胞轉染、篩選及鑒定Ramos細胞(由本室保存)用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養液在37℃、5%CO2、飽和濕度下培養。選取對數生長期細胞進行實驗。24孔板每孔接種5×105個Ramos細胞，懸于500 μL無抗生素、含10% FBS的1640培養液，按照LipofectamineTM2000說明書進行操作，將空載體pTARGET、pTARGET-mM-CSF、pTARGET-mMCSF-Δ質粒分別轉染Ramos細胞，分別命名為Ramos-V、Ramos-M和Ramos-Δ細胞。轉染后48 h，加入1 400 μg/mL G418進行篩選，每2 d換液1次，篩選后的第14天將細胞轉移至25 mL的培養瓶。穩定轉染的細胞株采用RT-PCR和Western blotting進行鑒定。收集Ramos-V、Ramos-M和Ramos-Δ細胞，用RT-PCR檢測mM-CSF、mM-CSF-Δ(mM-CSF鑒定引物Forward為5'-GCGCTTCAGAGATAACACC-3'，Reverse為5'-CCTCCGCCTCCACCTGTAGA-3';片段大小382 bp)和質粒自身的Neo基因(Forward為5'-GGTGGAGAGGCTATTCGGCT-3'，Reverse為5'-GATAGAAGGCGATGCGCTGC-3';片段大小728 bp)。按產品說明書，用TRIzol提取細胞總RNA，并用MML-V反轉錄酶將1 μg總RNA反轉錄為cDNA，以甘油醛三磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參(Forward為5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，Reverse為5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3';片段大小226 bp)，取2 μL進行PCR，進行25個循環，具體反應條件同1.2，產物經瓊脂糖凝膠電泳。收集Ramos-V、Ramos-M和Ramos-Δ細胞各5×106個，分別加入裂解液提取總蛋白。樣品經10% SDS-PAGE分離后，電轉至PVDF膜上，5%脫脂奶4℃封閉過夜，1∶200稀釋M-CSF抗體室溫孵育2 h，洗膜后1∶2 000稀釋二抗室溫孵育1 h，最后暗室中以化學發光法顯色，X線片曝光。RT-PCR在上述細胞株均能檢測出質粒所帶Neo基因; mM-CSF和mM-CSF-Δ分別表達于Ramos-M和Ramos-Δ細胞中(圖2)。Western blotting從蛋白水平檢測發現mM-CSF和mM-CSF-Δ在穩定轉染細胞中表達(圖3)。

1.4細胞增殖檢測采用MTT法。收集并計數細胞，分別用含10% FBS的RPMI1640培養液將細胞調整為1×105/mL，以每孔180 μL接種于96孔培養板，培養44 h后加入20 μL MTT(5 mg/mL)繼續培養4 h，離心后除去上清加入150 μL DMSO振蕩10 min后使用酶標儀檢測每孔于546 nm波長處的光密度(OD)值，實驗結果取5孔的均值。

1.5細胞周期檢測收集并計數已培養48 h的Ramos-V、Ramos-M和Ramos-Δ細胞各1×106cells，PBS洗1次，70%乙醇4℃固定24 h，離心棄上清，加RNaseA 5 μL(10 μg/μL)，室溫孵育15 min后加200 μL PI，避光室溫孵育30 min，流式細胞術檢測細胞周期。

1.6統計學方法采用SPSS13.0統計軟件。計量資料以珋x±s表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

Ramos-M、Ramos-Δ、Ramos-V細胞增殖能力的OD值分別為0.413±0.014、0.384±0.019、0.463 ±0.037，Ramos-M細胞與Ramos-Δ細胞比較，Ramos-M、Ramos-Δ細胞分別與Ramos-V細胞比較，P＜0.05或＜0.01。Ramos-M、Ramos-Δ、Ramos-V細胞處于G0/G1期的比例分別為41.54%±1.22%、45.60%±1.09%、39.20%±1.53%，Ramos-M細胞與Ramos-Δ細胞比較，Ramos-M、Ramos-Δ細胞分別與Ramos-V細胞比較，P＜0.05或＜0.01。

3　討論

M-CSF又稱集落刺激因子1(CSF-1)，經選擇性剪接形成的3種異構體均是c-fms原癌基因編碼跨膜糖蛋白M-CSF受體的配體［3］。其中，sM-CSF前體含外顯子編碼的蛋白酶切位點，可以被蛋白酶切釋放sM-CSF;但人mM-CSF前體分子缺乏相應的蛋白酶切位點而形成膜結合的形式［2］。M-CSF被認為是一個多功能的細胞因子，不僅在造血系統中擔負著調節單核/巨噬細胞增殖、分化等功能，而且還在婦科腫瘤、骨代謝、炎癥反應、甲狀腺癌、前列腺癌及一些中樞系統疾病中發揮重要作用［4～6］。

巨噬細胞是一種重要的免疫細胞，在不同的微環境被多種細胞因子或趨化因子活化形成不同的表型［7，8］，在腫瘤發展過程中充當一把“雙刃劍”。直腸癌微環境中的腫瘤相關巨噬細胞(TAM)通過分泌TNF-α、IL-6來增強腫瘤細胞的浸潤、轉移能力，促進腫瘤的進展［9］。研究［10］報道，TAM的分化也能被INF-γ抑制，降低膽囊癌中VEGF的濃度，減少膽囊癌血管產生，從而抑制膽囊癌的進展。mM-CSF作為細胞因子中的一員，對巨噬細胞功能極化的影響是腫瘤發展進程的關鍵。在肝癌、神經膠質瘤及乳腺癌中均發現，表達mM-CSF的腫瘤細胞能夠引起巨噬細胞的抗腫瘤免疫效應［11～13］;而mM-CSF與其受體介導的并置性刺激作用卻可促進血液惡性細胞增殖［1］，而且它可以通過異常活化巨噬細胞對血液系統惡性腫瘤的發展起促進作用［14］。mM-CSF在不同微環境中發揮不同作用，其機制越來越受到關注。

本文在不表達M-CSF受體的Ramos細胞中分別構建了穩定表達mM-CSF及胞內區截短30個氨基酸的mM-CSF(mM-CSF-Δ)細胞株，mM-CSF、mMCSF-Δ均能抑制淋巴細胞白血病Ramos細胞增殖，且后者抑制作用更強。可見，mM-CSF胞外區抑制Ramos細胞增殖作用更明顯，這為進一步深入研究mM-CSF在惡性腫瘤中的作用機制奠定了基礎。

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Inhibitory effect of mM-CSF and its spliceosome on proliferation of lymphocytic leukemia cell line Ramos

MA Cui-hua1，CHONG Jing-hui，LIAO Jin-feng，LIN Yong-min，WEI Jia，ZHENG Guo-guang
(1 Institute of Hematology＆Blood Diseases Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences，Tianjin 300020，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the inhibitory effect of membrane-bound macrophage colony-stimulating factor (mM-CSF) and its spliceosome (mM-CSF-Δ) on proliferation of lymphocytic leukemia cell line Ramos.Methods The eukaryotic expression plasmid of pTARGET-mM-CSF with mM-CSF was constructed with Overlap PCR，and then pTARGET-mM-CSF-Δ of 30 amino acide located in the intracellular region of brachytmema mutation was obtained; and meanwhile，they were identified by PCR and DNA sequencing.The empty vector pTARGET，pTARGET-mM-CSF and pTARGET-mM-CSF-Δ plasmid were transfected into Ramos cells，the cell line with stable expression was screened by G418 and was detected by RT-PCR and Western blotting.Proliferation and cell cycle of these stably transfected cells were detected by MTT and flow cytometry.Results The mM-CSF and mM-CSF-Δ eukaryotic expression vectors were successfully constructed.The stable transfectants Ramos-V，Ramos-M and Ramos-Δ were obtained.The OD of proliferation ability of Ramos-M，Ramos-Δ and Ramos-V were 0.413±0.014，0.384±0.019 and 0.463±0.037，respectively.Significant difference was found between the cell lines of Ramos-M and Ramos-Δ，among the cell lines of Ramos-M，Ramos-Δ and Ramos-V，respectively (P＜0.05 or P＜0.01).The proportion of G0/G1phases of Ramos-M，Ramos-Δ and Ramos-V cells were 41.54%±1.22%，45.60%±1.09% and 39.20%±1.53%，respectively.Significant difference was found betweenbook=2,ebook=121Ramos-M and Ramos-Δ cells，among Ramos-M，Ramos-Δ and Ramos-V cells (P＜0.05 or P＜0.01).Conclusion mM-CSF and mM-CSF-Δ may inhibit the proliferation of lymphocytic leukemia cell line Ramos and the inhibitory effect of the latter is stronger.

Key words:leukemia; Ramos cells; macrophage colony-stimulating factor; membrane-bound macrophage colonystimulating factor; spliceosome; cell proliferation; cell cycle

(收稿日期:2015-03-25)

通信作者簡介:鄭國光(1967-)，男，博士，研究員，研究方向為血液細胞生物學、分子生物學。E-mail: zhengggtjchn@ aliyun.com

作者簡介:第一馬翠花(1981-)，女，博士，助理研究員，研究方向為分子生物學。E-mail: michellemch@163.com

基金項目:國家自然科學基金資助項目(81170511，81370634) ;教育部新世紀優秀人才計劃(NCET-08-0329)。

文章編號:1002-266X(2015)19-0001-04

文獻標志碼:A

中圖分類號:R737.33

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.19.001