用基因芯片技術篩選人子宮內膜癌細胞株中紫杉醇耐藥相關基因

林鳳，鄭君，周友珍(首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院，北京100038)

用基因芯片技術篩選人子宮內膜癌細胞株中紫杉醇耐藥相關基因

林鳳，鄭君，周友珍
(首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院，北京100038)

摘要:目的應用基因芯片技術篩選人子宮內膜癌細胞株中獲得性紫杉醇(TAX)耐藥相關基因。方法采用大劑量間歇誘導法，用TAX反復沖擊誘導培養人子宮內膜癌Ishikawa細胞株，建成Ishikawa/TAX耐藥株。應用Affymetrix Human Genome U133 Plus2.0表達譜芯片檢測Ishikawa/TAX與Ishikawa細胞株基因。通過Gene Ontology (GO)聚類分析對差異表達的基因予以分類。采用qRT-PCR對部分差異表達的基因進行驗證。結果與Ishikawa細胞相比，Ishikawa/TAX細胞中有110條基因表達有顯著性差異(ratio比值＞3)，包括87個上調基因、23個下調基因，GO分類涉及細胞信號傳導和調控、細胞黏附分子、細胞代謝及轉錄調控等;其中上調最明顯的基因為S100A12，其次有CYP1B1、FUBP1、CEACAM6，下調基因有TNFAIP3、CD(44)、DKK1等。qRT-PCR檢測S100A12、CYP1B1在耐藥細胞中高表達，TNFAIP3、CD(44)在耐藥細胞中低表達，與基因芯片結果一致。結論采用基因芯片技術篩選出的人子宮內膜癌獲得性TAX耐藥相關基因的上調基因有S100A12、CYP1B1、FUBP1、CEACAM6，下調基因有TNFAIP3、CD(44)、DKK1。

關鍵詞:基因芯片技術;子宮腫瘤;子宮內膜癌;紫杉醇;耐藥基因

子宮內膜癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一，化療是子宮內膜癌主要的輔助治療手段，用于晚期、復發和早期高危患者。以紫杉醇(TAX)為基礎的聯合化療是治療子宮內膜癌的一線化療方案，但隨著用藥時間延長，化療耐藥的產生將導致治療失敗［1，2］。了解TAX耐藥機理，對逆轉耐藥以保證化療的有效性和患者長期生存具有重要意義。本研究通過大劑量沖擊方法建立了人子宮內膜癌TAX耐藥細胞株(Ishikawa/TAX)，應用高通量的Affymetrix Human Genome U133 Plus2.0基因芯片，比較耐藥細胞與敏感細胞之間基因譜表達的變化，旨在篩選出與子宮內膜癌TAX耐藥最為相關的基因，了解其耐藥機制，為臨床逆轉耐藥提供實驗依據。

1　材料與方法

1.1藥品與試劑TAX(批號: 050501)購自海南海藥股份有限公司。RNA提取試劑盒、RealqPCR Master Mix購自Exprogen公司; M-MLV逆轉錄酶、dNTP Mix、MgCl2購自Promega公司; RPMI1640培養基購自Gibco公司; RNA酶抑制劑、DTT、基因芯片及雜交試劑購自Affymetrix公司; TaqDNA聚合酶、real-time PCR試劑盒購自TaKaRa公司; Primers購自Invitrogen公司;小牛血清購自北京鼎國生物有限公司。

1.2Ishikawa/TAX耐藥細胞株的構建及鑒定人子宮內膜癌細胞株Ishikawa(由Nishida等1985年建株，北京大學人民醫院婦產科魏麗惠教授饋贈，本實驗室傳代保存)均培養在含10%小牛血清的RPMI1640培養基中，含2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素，置于37℃、5% CO2培養箱中培養。加入濃度為300 μg/mL的TAX作用2 h，PBS洗3遍，用普通培養液繼續培養，待細胞密度達70%～80%時傳代1次，同法進行第2次處理。如此反復處理13次，歷時8個月建成Ishikawa/TAX耐藥細胞株。MTT法檢測其耐藥性，計算耐藥指數。Ishikawa/TAX的群體倍增時間(Td)為(30.41±2.89) h，半數致死濃度(IC50)為(14.674±0.326)μg/mL; Ishikawa細胞Td為(20.56±2.67) h，IC50為(2.81±0.346)μg/mL，其耐藥指數為5.23 ±0.49，屬于中度耐藥。撤藥培養2個月后復測IC50不變;細胞凍存3個月后復蘇，其耐藥性穩定。取對數生長期Ishikawa及Ishikawa/TAX細胞，按TRIzol一步法抽提細胞總RNA，QIAGEN RNeasy Kit進一步純化總RNA，采用瓊脂糖凝膠電泳法測定總RNA含量，RIN鑒定RNA完整性。瓊脂糖凝膠電泳顯示28 S、18 S兩條帶清晰，無拖尾現象，表示RNA完整性良好，符合基因芯片標準。

1.3基因芯片的制備及相關基因檢測由RNA合成雙鏈DNA，以Oligo dT Primer為引物反轉錄合成第二鏈cDNA，然后經體外轉錄生成標記有生物素的cRNA，純化的cRNA片段化為35～200 bp的小片段，再與Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0芯片雜交，反復洗滌后染色，用GeneChip?Scanner 3000掃描芯片的熒光信號圖像。用基因芯片操作軟件GCOS1.2對圖像進行數據定量處理和分析，差異基因的篩選標準為T檢驗P＜0.05且差異倍數＞2。根據Gene Ontology(GO，http://www.geneontology.org)及Netaffy(http://www.affymetrix.com)對基因的注釋，對差異顯著的基因按照分子功能、細胞組分及生物學行為進行分類，再按生物學行為做GO聚類分析，并在GenBank中明確其功能。

1.4差異表達部分基因的mRNA檢測采用qRTPCR進行驗證。根據GenBank人類基因的cDNA序列，應用引物設計軟件Primer5.0設計引物，引物由美國Invitrogen公司合成。提取細胞總RNA，逆轉錄為cDNA，行PCR及預實驗，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物在100 bp附近有擴增條帶，證明為陽性。再行SYBR GREEN real-time PCR檢測。取定量PCR專用的96孔板，每孔加入cDNA 1 μL、RealqPCR Master Mix 12 μL、引物F/R(上下游引物的終濃度各為15 pmol/μL) 0.5/0.5 μL，用雙蒸水補足體系至25 μL，封膜，用ABI7900HT定量PCR儀進行檢測。PCR反應條件:先50℃、2 min，95℃、10 min;然后95℃、15 s，60℃、1 min，共40個循環(生成擴增曲線) ;最后95℃、15 s，60℃、15 s，95℃、15 s(生成溶解曲線)。記錄每個反應管中的熒光信號到達所設定的域值時所經歷的循環數，即Ct值。利用管家基因對目的基因的表達進行校正，得出相對定量結果。每次反應均做3個復孔，Ct值取其均值。以18 S作為內參照，同時以親代細胞Ishikawa作為基準，Ishikawa/TAX耐藥細胞mRNA的表達量表示成親代細胞的N倍。N=2－ΔΔCt，樣品Ct－基準Ct=(Ct樣品－Ct樣品18S)－(Ct基準－Ct基準18S)。

1.5統計學方法采用SPSS11.0統計軟件。計量資料以珋x±s表示，采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

共篩選出1 400余條差異基因。通過提高篩選標準(ratio值＞3)同時去除轉錄本重復及功能尚未明確的基因后，發現Ishikawa/TAX耐藥細胞與Ishikawa細胞之間有110條基因差異顯著，其中87條在耐藥株中上調，23條在耐藥株中下調。110條差異基因的生物學功能主要集中在細胞信號轉導及調控、細胞黏附、細胞代謝及轉錄等幾個方面。通過對篩選出的基因進一步分析，挑選出了7條與耐藥關系最密切的基因(詳見表1)。其中，Ishikawa/TAX耐藥細胞株中S100A12和CYP1B1的mRNA表達分別是Ishikawa細胞的39.397倍、2.497倍，TNFAIP3、CD44的mRNA表達是Ishikawa細胞的0.473倍、0.902倍，兩者比較，P均＜0.05。結果與基因芯片一致，該基因芯片結果的可信性高。

3　討論

TAX化療耐藥的產生機制可能是一個多基因、多因素、多步驟的復雜生物過程，涉及腫瘤細胞、機體、靶組織的相互影響和作用，涉及一系列腫瘤相關基因的調節和信號傳導。基因芯片技術具有高通量、大規模、高靈敏性、高度自動化和重復性的特點，是尋找耐藥相關基因以及了解各基因之間復雜的相互調控關系的最好方法［3］。人類全基因組Affymetrix Human Genome U133 Plus2.0表達譜芯片包括人類全基因組47 000個轉錄本，代表了38 500個明晰的人類基因，其強有力的探針集以及一個轉錄本有多重獨立探針檢測，提供了最大的準確性和重復性，是目前研究腫瘤的發生發展和化療耐藥機理最有效的方法。能幫助我們從分子水平全面了解腫瘤耐藥機制，尋找腫瘤耐藥標志物，發掘腫瘤耐藥的基因治療的有效靶點，對腫瘤的早期診斷、個體化治療、預后判斷等有其他方法不可比擬的優勢［4，5］。

本實驗通過該芯片技術檢測了子宮內膜癌TAX耐藥細胞Ishikawa/TAX與敏感細胞之間的基因表達譜，發現有110條基因差異顯著，其中87條在耐藥株中上調、23條在耐藥株中下調。根據GO 及Netaffy對基因的注釋，再對這些基因進行分子功能及生物學行為GO聚類分析，發現差異表達基因分別屬于多個分子功能家庭，參與多個生物過程。通過對篩選出的基因進一步分析，發現有7個差異表達基因可能參與了Ishikawa/TAX細胞的耐藥機制，其中上調最明顯的基因為S100A12，其次為CYP1B1、FUBP1、CD66c;明顯下調的基因有TNFAIP3、CD44、DKK1。其編碼蛋白涉及細胞信號傳導和調控、細胞黏附及氧化還原反應等。我們選擇了涉及NF-κB信號通路基因S100A12、TNFAIP3及細胞黏附分子CD44、CYP1B1基因進行了進一步的驗證，結果與芯片一致。

NF-κB是一種重要的細胞核轉入因子，除了參與炎癥、免疫、細胞分化及凋亡等生理功能外，還與腫瘤發生、發展、浸潤及化療耐藥有關［6］。化療藥物激活NF-κB/IκB信號通路是產生誘導性耐藥的重要機制。NF-κB/IκB信號通路的過度活化，是導致卵巢癌耐藥細胞COC1/DDP對順鉑耐藥的重要原因之一。Ⅱ型子宮內膜癌的化療耐藥也與高水平的Nrf2密切相關［7］。S100A12是近年發現的S100蛋白家族成員之一，通過正向調控NF-κB的級聯反應發揮促炎、調節免疫反應、抗微生物等生物學功能。關于S100A12與化療耐藥的關系尚未見報道。TNFAIP3又稱鋅指蛋白A20，是一種具有抗細胞凋亡及抑制NF-κB活化雙重功能的胞液蛋白。在耐藥細胞株中，TNFAIP3的持續低表達可能通過激發RIP依賴的信號級聯反應從而調控NF-κB介導的細胞生存，降低細胞凋亡水平，導致腫瘤細胞產生耐藥。本實驗發現，S100A12在Ishikawa/TAX耐藥株中表達上調最明顯，TNFAIP3在耐藥株中表達明顯下調，推測S100A12、TNFAIP3基因可能通過調控NF-κB信號通路及細胞凋亡，在子宮內膜癌對TAX的獲得性耐藥中起主要作用。

CYP1B1基因為CYP1B1亞族的惟一成員，與其他P450酶不同，其在正常組織中不表達或表達水平很弱，但在子宮內膜癌、乳腺癌、前列腺癌等多種腫瘤組織中表達過量［8，9］。CYP450是體內重要氧化還原酶系，可以催化眾多的內源性物質如脂肪酸、類固醇激素、外源性物質和進入體內的藥物的代謝，使藥物失活加速。Martinez等［10］研究發現，TAX是p糖蛋白外排轉運的底物，主要通過細胞色素P450酶代謝。CYP1B1基因mRNA和蛋白的表達量在一定程度上能夠反映卵巢癌細胞對TAX的敏感性，可能由于高表達的CYP1B1酶增加了對TAX的代謝而導致耐藥。本實驗發現CYP1B1在Ishikawa/TAX耐藥株中上調最明顯，提示它可能通過氧化還原反應調節TAX耐藥。

CD44是一種細胞表面跨膜糖蛋白，其正常功能是作為透明質酸受體參與細胞—細胞、細胞—基質之間的特異性黏附過程。CD44與宮頸癌、乳腺癌、胃癌等多種惡性腫瘤的發生、發展、浸潤及轉移關系密切。Zieker等［11］報道，CD44表達下調可導致多細胞團簇化療耐藥。CD44和抑制凋亡蛋白Bcl-2表達呈負相關，而BcL-2家族蛋白持續高表達又是引起多細胞團簇化療耐藥的原因。本實驗結果顯示，在耐藥株中CD44表達明顯下調，提示細胞黏附分子參與了TAX的獲得性耐藥過程，與文獻報道一致。

子宮內膜癌TAX化療耐藥是一個多基因、多環節、多途徑參與的過程，可能涉及影響不同生化途徑的多群遺傳因子表達的改變。本實驗利用基因芯片技術，通過生物信息學分析數據的方法，篩選和鑒定了子宮內膜癌TAX獲得性耐藥細胞Ishikawa/TAX的基因表達譜。為進一步研究TAX耐藥的分子機理、尋找逆轉耐藥的靶點和方法提供了線索。

參考文獻:

［1］Moxley KM，McMeekin DS.Endometrial carcinoma: a review of chemotherapy，drug resistance，and the search for new agents［J］.Oncologist，2010，15(10) : 1026-1033.

［2］Burke WM，Orr J，Leitao M，et al.Endometrial cancer: a review and current management strategies: partⅡ［J］.Gynecol Oncol，2014，134(2) : 393-402.

［3］Kharma B，Baba T，Mandai M，et al.Utilization of genomic signatures to identify high-efficacy candidate drugs for chemorefractory endometrial cancers［J］.Int J Cancer，2013，133(9) : 2234-2244.

［4］Roukos DH.Genome network medicine: innovation to overcome huge challenges in cancer therapy［J］.Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med，2014，6(2) : 201-208.

［5］M?bert K，Cojoc M，Peitzsch C，et al.Cancer biomarker discovery: Current status and future perspectives［J］.Int J Radiat Biol，2014，90(8) : 659-677.

［6］Girouard J，Lafleur MJ，Parent S，et al.Involvement of Akt isoforms in chemoresistance of endometrial carcinoma cells［J］.Gynecol Oncol，2013，128(2) : 335-343.

［7］Jiang T，Chen N，Zhao F，et al.High levels of Nrf2 determine chemoresistance in typeⅡendometrial cancer［J］.Cancer Res，2010，70(13) : 5486-5496.

［8］Sprowl JA，Reed K，Armstrong SR，et al.Alterations in tumor necrosis factor signaling pathways are associated with cytotoxicity and resistance to taxanes: a study in isogenic resistant tumor cells ［J］.Breast Cancer Res，2012，14(1) : R2.

［9］Pastina I，Giovannetti E，Chioni A，et al.Cytochrome 450 1B1 (CYP1B1) polymorphisms associated with response to docetaxel in Castration-Resistant Prostate Cancer (CRPC) patients［J］.BMC Cancer，2010，(10) : 511.

［10］Martinez VG，O'Connor R，Liang Y，et al.CYP1B1 expression is induced by docetaxel: effect on cell viabilitiy and drug resistance ［J］.Br J Cancer，2008，98(3) : 564-570.

［11］Zieker D，Bühler S，Ustündag Z，et al.Induction of tumor stem cell differentiation-novel strategy to overcome therapy resistance in gastric cancer［J］.Langenbecks Arch Surg，2013，398(4) : 603-608.

·基礎研究·

Application of gene chip technology for screening and identifying taxol-resistant related genes in human endometrial carcinoma cell line

LIN Feng，ZHENG Jun，ZHOU You-zhen
(Beijing Shijitan Hospital of Capital Medical University，Beijing 100038，China)

Abstract:Objective To screen and identify the acquired taxol (TAX) -resistant related genes in human endometrial carcinoma cell line by applying gene chip technology.Methods We established the Ishikawa/taxol (TAX) -resistant cell line by intermittent and repeated exposure to TAX of a high concentration on the human endometrial carcinoma cell line Ishikawa.The genes of Ishikawa/TAX and Ishikawa cells were examined by using Affymetrix Human Genome U133 Plus2.0 expression profile chip.The differentially expressed genes were classified by Gene Ontology (GO) cluster analysis.Realtime quantitative PCR (qRT-PCR) was performed to confirm part of the differentially expressed genes.Results Compared with Ishikawa cells，there were 110 significantly differential expression genes in Ishikawa/TAX cells (ratio＞3)，of which the up-regulated and down-regulated genes were 87 and 23，respectively.The classification of GO involved the cell signal transduction and regulation，cell adhesion molecule，cell metabolism and transcription regulation，etc.S100A12 was upregulated significantly，followed by CYP1B1，FUBP1 and CEACAM6.TNFAIP3，CD(44)and DKK1 were significantly downregulated.The qRT-PCR showed that S100A12 and CYP1B1 was highly expressed in the drug-resistant cells，and TNFAIP3 and CD(44)was lowly expressed in the drug-resistant cells，which coincided well with the results of cDNA microarray.ConclusionGene chip technology screens that the up-regulated genes of acquired TAX-resistant related genes in human endometrial carcinoma cell line are S100A12，CYP1B1，FUBP1 and CEACAM6，and the down-regulated genes are TNFAIP3，CD(44)and DKK1.

Key words:gene chip technology; uterine neoplasms; endometrial carcinoma; paclitaxel;drug-resistant gene

(收稿日期:2015-02-19)

通信作者簡介:周友珍(1965-)，女，主任醫師，研究方向為婦科惡性腫瘤化療耐藥及逆轉。E-mail: bjzhouyouzhen@163.com

作者簡介:第一林鳳(1986-)，女，住院醫師，研究方向為婦科惡性腫瘤化療耐藥。E-mail: linfeng5698@ sina.com

文章編號:1002-266X(2015) 19-0021-04

文獻標志碼:A

中圖分類號:R737.31

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.19.007