SBR融合蛋白和減毒沙門氏菌免疫對小鼠涎腺CCL28 mRNA表達的影響及意義

丁廣德，姚麗，楊桂梅

(山東中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，濟南250001)

SBR融合蛋白和減毒沙門氏菌免疫對小鼠涎腺CCL28 mRNA表達的影響及意義

丁廣德，姚麗，楊桂梅

(山東中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，濟南250001)

目的 探討純化的變形鏈球菌唾液結(jié)合區(qū)段(SBR)頜下腺注射和減毒沙門氏菌(SL)灌胃免疫對小鼠涎腺黏膜相關(guān)上皮因子CCL28 mRNA表達的影響。方法 將120只BALB/C小鼠隨機分為SBR組及SL組各60只。SBR組行SBR融合蛋白頜下腺注射免疫,SL組行SL灌胃免疫。免疫48 h、1周、2周時采用ELISA法檢測SBR組唾液中SBR特異性抗體(SBR-IgA)水平； RT-PCR法檢測兩組頜下腺組織CCL28 mRNA相對表達量。用另選5例BALB/C正常小鼠作為對照組。結(jié)果 SBR組免疫48 h及1周、2周時唾液中SBR-IgA水平均明顯高于對照組，P均<0.05；SBR組和SL組頜下腺組織CCL28 mRNA相對表達量均高于對照組(P均<0.05)。結(jié)論 SBR融合蛋白經(jīng)頜下腺接種可誘導小鼠明顯的抗體應答；經(jīng)頜下腺和經(jīng)胃接種疫苗后涎腺CCL28的表達明顯增高。

變形鏈球菌；減毒沙門氏菌；齲病；黏膜相關(guān)上皮趨化因子

唾液中的分泌型IgA(SIgA)在維護口腔健康、抑制致齲菌斑的形成中有重要作用，被認為是抵御齲病病原菌的第一道防線。提高唾液中抗致齲菌變形鏈球菌的特異性抗體水平是防治齲病的有效途徑。黏膜相關(guān)上皮趨化因子CCL28是近年來發(fā)現(xiàn)的CC家族趨化因子，其受體為CCR10和CCR3[1,2]。研究發(fā)現(xiàn)，CCL28 mRNA主要分布于唾液腺、前列腺等組織。有報道稱人類CCL28可殺死白色鏈球菌、綠膿桿菌、化膿性鏈球菌、克雷伯肺炎桿菌、金黃色葡萄球菌等細菌[3～5]。涎腺既是黏膜免疫的誘導部位，同時也是效應部位。有研究表明，在涎腺局部行免疫接種，可誘導明顯的以唾液特異IgA升高為特征的黏膜免疫應答[6]。2014年1～5月，我們分別觀察了純化的變形鏈球菌唾液結(jié)合區(qū)段(SBR)融合蛋白頜下腺注射及減毒沙門氏菌(SL)灌胃對小鼠頜下腺內(nèi)CCL28 mRNA和特異性抗體表達的影響。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物分組及處理 實驗動物為125只SPF級BALB/C小鼠。取120只隨機分為SBR和SL組和各60只，兩組均常規(guī)飼養(yǎng)于SPF動物房，自由進食水。SBR組行SBR融合蛋白頜下腺注射免疫：于雙側(cè)頜下腺區(qū)域注射SBR融合蛋白，每只注射40 μg。SL組行SL灌胃免疫：灌胃前4 h撤去飼料和水，灌胃前30 min用5%NaHCO360 μL灌胃中和胃酸；調(diào)SL濃度至1010/mL，取200 μL灌胃。另5只為空白對照組(對照組)，自由進食水。

1.2 相關(guān)指標觀察 免疫48 h及1、2周時，SL組和SBR組分別處死小鼠20只，取唾液0.2 mL和頜下腺組織0.1 g。頜下腺組織制作標本，-70 ℃凍存。

1.2.1 唾液SBR特異性抗體(SBR-IgA)水平 采用ELISA法。取SBR組唾液樣品稀釋5倍后加到酶標板的各反應孔中，0.1 mL/孔，將微量酶標板用塑料保鮮膜封好，37 ℃孵育2 h；將辣根過氧化酶標記羊抗小鼠SBR-IgA稀釋，然后將辣根過氧化酶標記羊抗小鼠SBR-IgA(1∶5 000)加到酶標板各反應孔中，用塑料保鮮膜封好，37 ℃孵育2 h；于各反應孔中加入TMB底物，每孔0.1 mL，用塑料保鮮膜封好，37 ℃蔽光顯色5～30 min，當出現(xiàn)明顯的顏色變化時于酶標板各反應孔中加入50 μL終止液(2 mol/L H2SO4)終止反應。于酶標儀上測定各反應孔的OD450值，即唾液SBR-IgA水平。

1.2.2 頜下腺組織CCL28 mRNA表達 采用RT-PCR法。取兩組凍存的頜下腺組織按每50～100 mg 組織加入1 mL Trizol提取頜下腺組織總RNA；按照TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver 2.1試劑盒說明書，提取總RNA(約8 μg)，RNase Inhibitor 0.5 μL，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL等，混勻后置于PCR儀中，55 ℃、30min，99 ℃、5 min，5℃、 5min，終止反應。取同一個反應體系的逆轉(zhuǎn)錄反應產(chǎn)物cDNA 2.5 μL，β-actin上、下游引物各5 μL，目的基因上、下游引物各5 μL，Taq聚合酶0.25 μL，退火溫度61 ℃、40 min，進行PCR反應；取PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠上電泳，在紫外燈下觀察電泳帶，凝膠成像分析系統(tǒng)掃膠拍照，應用軟件測定電泳條帶的密度值，計算目的基因片段電泳帶密度與β-actin基因片段電泳帶密度的相對值，即CCL28 mRNA相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 唾液SBR-IgA水平 SBR組免疫48 h及1、2周時唾液中SBR IgA水平分別為0.063±0.009、0.053±0.005、0.060±0.017，均高于對照組的0.036±0.009，P均<0.05。免疫各時點唾液SBR-IgA比較無統(tǒng)計學差異。

2.2 頜下腺組織CCL28 mRNA表達 免疫48 h、1周、2周時SBR組頜下腺組織CCL28 mRNA相對表達量分別為0.245±0.006、0.245±0.009、0.241±0.007； SL組分別為0.255±0.009、0.239±0.006、0.248±0.005，對照組為0.121±0.008。SBR組和SL組免疫各時點CCL28 mRNA相對表達量均高于對照組(P均<0.05)。SBR組及SL組免疫各時點CCL28 mRNA相對表達量比較差異均無統(tǒng)計學意義。

3 討論

研究證實，經(jīng)靶向頜下腺免疫小鼠后，在其頜下腺內(nèi)由效應細胞產(chǎn)生的細胞因子能夠影響抗原特異性反應，因此檢測其頜下腺細胞內(nèi)細胞因子特異性mRNA的表達非常重要。本研究發(fā)現(xiàn)，SBR頜下腺免疫小鼠頜下腺組織中CCL28 mRNA相對表達量較高，說明SBR免疫可使CCL28mRNA轉(zhuǎn)錄生成增多。鑒于真核細胞基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子(即一個編碼基因轉(zhuǎn)錄一次只生成一個mRNA分子)，而且在本研究中除了應用SBR蛋白經(jīng)靶向頜下腺免疫動物外，未加任何其他因素調(diào)節(jié)mRNA的轉(zhuǎn)錄，因此CCL28 mRNA相對表達量可反映SBR蛋白靶向頜下腺免疫CCL28基因的轉(zhuǎn)錄活性狀態(tài)。

研究表明，通過某黏膜途經(jīng)接種疫苗產(chǎn)生的特異性IgA不但可遷徙至接種的黏膜組織處，還可歸巢至其他黏膜免疫部位；抗原在腸道被抗原遞呈細胞捕獲處理后運送到PEYRE結(jié)等黏膜相關(guān)淋巴組織，在這里捉捕并處理了抗原的抗原遞呈細胞如樹突狀細胞、B細胞等與抗原特異性Th淋巴細胞相互作用，產(chǎn)生免疫應答。其中致敏的部分B細胞經(jīng)轉(zhuǎn)型重組后，成為抗原特異性IgA抗體分泌細胞(IgA+ASC)； IgA+ASC經(jīng)淋巴管進入血循環(huán)，遷徙歸巢至機體的黏膜免疫效應部位如涎腺、淚腺等外分泌腺和呼吸道黏膜固有層、腸黏膜固有層等，在這些部位最終分化為漿細胞，產(chǎn)生并分泌IgA，發(fā)揮效應作用[6]。近期研究表明，趨化性細胞因子CCL28在IgA+ASC經(jīng)血循環(huán)選擇性地在某些黏膜免疫效應部位歸巢的過程中起關(guān)鍵作用；涎腺上皮細胞表達分泌至涎腺腺泡間組織中的CCL28可通過某種機制轉(zhuǎn)運到局部毛細血管后靜脈內(nèi)皮細胞游離面，通過與IgA+ASC細胞表面的趨化性細胞因子受體CCR10特異結(jié)合來啟動IgA+ASC出血管機制，引導IgA+ASC遷徙歸巢至涎腺[7]。涎腺上皮細胞表達的CCL28也可部分地分泌至腺泡腔，隨唾液進入口腔[8]。可見涎腺的雙向分泌特征使得其局部產(chǎn)生的CCL28在口腔防御中發(fā)揮重要作用。

共同黏膜免疫系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)及其作用原理的闡明、新型的黏膜免疫遞送系統(tǒng)和黏膜免疫佐劑的發(fā)現(xiàn)及成功應用均為防齲DNA疫苗經(jīng)黏膜免疫接種來誘導特異的體液和黏膜免疫反應奠定了基礎(chǔ)[9～11]。通過黏膜途經(jīng)作免疫接種具有經(jīng)濟、簡便的特點，可刺激黏膜免疫系統(tǒng)和全身系統(tǒng)性免疫系統(tǒng)的應答，誘導局部產(chǎn)生長時間的免疫記憶[12,13]。唾液腺作為共同黏膜免疫系統(tǒng)的效應部位能分泌保護性抗體IgA，是通過免疫接種防治齲病及其他感染性口腔疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)，通過黏膜免疫途經(jīng)接種防齲疫苗將有望成為免疫防齲的主要方式。本研究SBR免疫后小鼠頜下腺IgA水平升高，也證明了上述理論。

[1] Alison EJ, Molly ST, Aaron AB, et al. Temporal production of CCL28 corresponds to eosinophil accumulation and airway hyperreactivityin allergic airway inflammation[J].Am J Pathol, 2005,166(2) :345-353.

[2] Karen E, Claire B, Paul C, et al. Inflammation of the respiratory tract is associated with CCL28 and CCR10 expression in a murine model of allergic asthma[J]. Immunol Lett, 2006,103(2):92-100.

[3] Nakayama T, Shirane J, Hieshima K, et al.Novel antiviral activity of chemokines[J]. Virology, 2006,350(2):484-492.

[4] Allen SJ, Crown SE,Handel TM.Chemokine: receptor structure,interactions,and antagonism[J]. Annu Rev Immunol,2007,25：787-820.

[5] Liu B,Wilson E. The antimicrobial activity of CCL28 is dependent on C-terminal positively-charged amino acids[J]. Eur J Immunol, 2010,40(1):1-11.

[6] Ningguo FN,Marl′a CJ,Nicole HL,et al. Redundant role of chemokines CCL25/TECK and CCL28/MEC in IgA+plasmablast recruitment to the intestinal lamina propria after rotavirus infection[J]. J Immunol, 2006,176(10):5749-5759.

[7] Patrik S, Samuel BL, Lars-Aoke N, et al. Human IgA-secreting cells induced by intestinal, but systemic, immunization respond to CCL25 (TECK) and CCL28(MEC)[J]. Eur J Immunol, 2008,38(12):3327-3338.

[8] Berri M, Virlogeux-Payant I, Chevaleyre C,et al. CCL28 involvement in mucosal tissues protection as a chemokine and as an antibacterial peptide[J]. Dev Comp Immunol,2014,44(2):286-290.

[9] Cuburu N, Kweon MN, Song JH, et al. Sublingual immunization induces broad-based systemic and mucosal immune responses in mice[J]. Vaccine, 2007,25(51):8598-8610.

[10] Han TK, Dao ML. Enhancement of salivary IgA response to a DNA vaccine against Streptococcus mutans wall-associated protein A in mice by plasmid-based adjuvants[J]. J Med Microbiol, 2007,56(5):675-680.

[11] Liu GX, Xu QA, Jin J, et al. Mucosal and systemic immunization with targeted fusion anti-caries DNA plasmid in young rats[J]. Vaccine,2009,27(22):2940-2947.

[12] Gargett T, Grubor-Bauk B, Miller D, et al. Increase in DNA vaccine efficacy by virosome delivery and co-expression of a cytolytic protein[J]. Clin Transl Immunol, 2014,3(6):18.

[13] Rose MA. Mucosal immunization in perspective[J]. Hum Vaccin Immunother, 2014,10(7):2115-2117.

10.3969/j.issn.1002-266X.2015.06.011

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1002-266X(2015)06-0031-03

2014-11-12)