簡述豬藍耳病（PRRS）的診斷技術

黎先偉 譯

迄今為止，無論花費了多大的成本和努力，我們仍沒有建立一套有效的預防、控制和清除豬繁殖與呼吸綜合征（藍耳病，PRRS）的策略。不過，對我們獸醫工作者來說，掌握最佳的診斷方法來準確的提前預判豬場藍耳病穩定與否是非常重要的。目前，有什么工具和/或手段來協助我們呢？下面我們將一一闡述。

豬繁殖與呼吸綜合征是一種病毒性、災難性的傳染病。其臨床表現為母豬嚴重的繁殖障礙、斷奶仔豬普遍發生肺炎、生長遲緩以及死亡率增加等癥狀。豬藍耳病是一個全球性的問題，對世界養豬業和經濟造成非常重要的影響。單單在美國，每年由于豬藍耳病對養豬業所造成的損失估計可達到6.64億美元。

為了應對這些挑戰，研發和實施一種可靠的、準確的和及時的診斷措施是有效防控豬藍耳病的一個重要組成部分。隨著診斷技術的日益發展，對于獸醫和養豬業的利益相關者來說，繼續采取最佳的措施以協調應對疾病的發展，從而保持整個行業的穩定是非常重要的。

一、選擇合適的診斷方法

選擇一種合適的豬藍耳病診斷方法最為關鍵的第一步是，確定實施檢測的目標。這些目標可能包括在一個群體中檢測出至少一頭受感染的動物；判斷病毒在群體中的流行情況；確定分離的是野毒還是疫苗毒，或評估感染的時間。這些因素將取決于待檢測的動物、需求樣品的數量以及合適組織的使用。此外，個別動物的檢測結果可能不能很好的反應整個群體的狀態，因為每個動物感染的狀態都有所差異，所以我們在分析結果時必須多加注意。

二、選擇合適的樣本數

當選擇合適的用于診斷豬藍耳病的樣本數時，需要考慮到多種因素。為了從一個群體中鑒定出至少一份陽性樣本，需要考慮的因素包括群體大小、群體內疾病的預期流行率、所需確定性的程度，以及所采用的檢測方法的敏感性和特異性。

檢測的時機也是非常重要的，因為感染和免疫反應的多種方面，包括病毒血癥、病毒釋放、抗體應答和特征性病變僅會在特定的時間內出現。

三、選擇合適的組織樣本

一般來說，診斷檢測大體分為兩類：病毒（抗原）檢測和病毒抗體檢測。病毒（抗原）檢測需要采集富含病毒的組織、支氣管肺泡灌洗液（BALF）、胸腔液、精液、血液、唾液或環境樣本；而病毒抗體檢測則需要采集血液（血清）、唾液或肌肉滲出液等，以檢測抗藍耳病抗體的水平。因此，組織樣本的選擇取決于多種不同的因素，包括特定的檢測目的、所選擇的診斷方法和可用的設備。

四、診斷方法

自從發現豬藍耳病以來，人們已采用過各種不同的技術和/或方法來檢測豬藍耳病病毒（PRRSv）及其抗體，目前其中一些診斷技術和/或方法很少用于臨床診斷，這有多方面的原因：首先可能是這種方法更適用于實驗室；第二該方法需要耗費過長的時間；第三成本昂貴或需要專業培訓過的人員等等。在下本中，我們將簡要描述現在針對豬藍耳病主要采用的檢測技術，同時談及一些較為傳統的方法以闡明近幾年來診斷技術和/或方法已發展到什么程度。

五、豬藍耳病病毒（PRRSv）的檢測

病毒的檢測技術可對疾病感染的狀態作出一個很好的指示，不過這些技術和/方法往往主要作為實驗室研究的工具，因為它們的操作需要經過專業培訓的實驗人員、而且成本較高以及所需的時間較長。一旦從樣本中分離到病毒，可使用特定的細胞系通過一系列的感染和復制從組織樣本中擴增病毒。另一種方法就是采用電子顯微鏡直接觀察病毒，不需要通過特定分子或抗體來識別病毒，這在描繪新病毒株方面具有重要的作用。目前，新型、快速和低成本的診斷技術（見下文描述）已被廣泛使用，這些技術對于常規和快速診斷具有更高的實用性和便捷性。

1.反轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）。當懷疑病毒具有垂直傳播的特性時，可選擇胎兒樣本進行反轉錄-聚合酶鏈反應。該方法可用于快速的、特異的和高度敏感的從不同的組織（包括血清、精液、唾液、肺組織、淋巴結、脾臟和扁桃體）和環境樣本中檢測豬藍耳病病毒。這個方法的主要步驟包括從組織樣本中抽提病毒RNA；RNA通過逆轉錄為DNA；DNA的PCR擴增以及擴增DNA的檢測。

反轉錄-聚合酶鏈反應的缺點是組織樣本之間和動物之間感染后病毒的檢測會有差異。此外，RTPCR的高度敏感性可能會由于樣本受污染而出現假陽性，而特定的引物對一些容易變異的病毒往往容易出現假陰性的結果。

2.免疫組化（IHC）。免疫組化方法可用于從不同部位的組織（包括肺臟、淋巴結、胸腺、扁桃體、脾臟和腎臟）中檢測豬藍耳病病毒。簡單來說，先用福爾馬林固定組織樣本，隨后用針對病毒核衣殼的單克隆抗體進行標記。最后采用一種經標記的第二抗體通過顯微鏡直接觀察組織中是否存在病毒。雖然免疫組化具有高度的特異性（100%），但是其僅有中等的敏感性（67%）。不過，在固定的48h內處理組織可有效改善免疫組化的敏感性。在感染早期，敏感性的程度是最高的；而在感染后期階段，敏感性的程度會逐漸下降，如感染后超過28d，更不用說感染后超過90d。雖然免疫組化可有效鑒別仔豬中垂直傳播的病毒，但是對于一些容易變異的病毒，這種方法往往難以達到理想的效果。

3.熒光抗體染色法（FA）。熒光抗體染色法，通常用于評估支氣管肺泡灌洗液（BALF）或新鮮/冰凍的肺組織的病毒感染情況，不過目前該方法臨床上較少使用。在該技術中，樣本直接用熒光抗體進行標記來觀察病毒粒子。對于檢測豬藍耳病病毒來說，這種方法要比免疫組化法更為快捷和便宜，但是與免疫組化相比，熒光抗體染色法不能檢測病毒株的遺傳多樣性，而且不推薦在感染后期使用這種方法。此外，熒光抗體染色可能也存在假陽性的問題，這可能是由于原始抗體或高背景染色的特異性較差所造成的。

4.臨床試紙條檢測。試紙條檢測在豬藍耳病病毒的診斷中是一種比較新的技術，盡管尚未得到廣泛的應用，但是這種方法可快速、便捷的檢測出豬藍耳病病毒，而不需要專業的知識或設備。試紙條通過免疫層析法檢測血清或組織勻漿中的病毒。簡單來說，這種方法的原理是樣本中的病毒與針對豬藍耳病病毒特定蛋白的金標單克隆抗體相混合，形成蛋白-抗體復合物聚集在試紙條內。隨后用一種經標記的第二抗體檢測聚集的蛋白-抗體復合物。目前，這種方法暫時只適用于有限的病毒。

六、豬藍耳病病毒特異性抗體的檢測

血清中豬藍耳病病毒特異性抗體的檢測是診斷豬藍耳病最為常用的方法，此外，也可以用唾液樣本或肌肉滲出液來進行檢測。在美國，自從2010年以來，采用唾液樣本來診斷豬藍耳病的比例大幅增加。

豬藍耳病病毒抗體的檢測是一個不斷發展的診斷學科。一些方法和/或技術與時間和資源問題有關，目前主要用于實驗室研究。這些方法和/或技術包括免疫過氧化物酶單層細胞試驗法（IPMA），一種高度特異且敏感的方法，而且是首次報道用于豬藍耳病診斷的血清學方法。在這個試驗中，經過氧化物酶標記的第二抗體檢測的受病毒感染的細胞中的抗豬藍耳病病毒抗體富集于微孔板內。隨后通過光學顯微鏡來評估陽性樣本。同樣，病毒中和（VN）會產生難以解釋的結果。

雖然抗體檢測可鑒定出新的豬藍耳病病毒感染，但是這不適于監測以往受過感染的群體，因為這種方法無法區別這些是新感染、舊感染還是接種疫苗所產生的抗體。

1.酶聯免疫吸附試驗。酶聯免疫吸附試驗是檢測豬藍耳病病毒抗體中最為常用的一種方法。2010年愛荷華州立大學的研究已證實，酶聯免疫吸附試驗的特異性可高達99.9%，敏感性也能達到98.8%。微孔表面覆蓋大量的豬藍耳病病毒融合（N）蛋白用來捕獲組織樣本中的抗豬藍耳病病毒抗體，隨后用過氧化物酶標記的抗體顯示捕獲的抗豬藍耳病病毒。

雖然酶聯免疫吸附試驗既快捷又方便，但這種方法也有其局限性。免疫反應在動物和檢測抗體的水平之間通常是可變的，這不一定能反映病毒的毒力。此外，母源抗體和飼料中的抗體可能也會影響最終的結果。早期感染期間的可能會出現假陰性也是需要關注的一個問題。

2.熒光微球免疫分析法（FMIA）。熒光微球免疫分析法是一種多重版的酶聯免疫吸附試驗，即采用不同的染色熒光微球來捕獲多種抗豬藍耳病病毒抗體，隨后用熒光標記的第二抗體進行標記。這種技術可在單一的小樣本中同時檢測幾種不同的抗體。研究結果證實，熒光微球免疫分析法對血清樣本的敏感性和特異性分別可達到98%和95%。此外，眾所周知傳統的方法用于檢測唾液樣本的敏感性較低，但采用FMIA的敏感性和特異性則分別可達到92%和95%。而且對于早期感染的檢測，FMIA要比ELISA具有更高的敏感性。

3.間接免疫熒光試驗（IFA）。

間接免疫熒光試驗與免疫過氧化物酶單層細胞試驗法相似，不同的是使用熒光標記的第二抗體來檢測捕獲的抗豬藍耳病病毒抗體。研究已表明，間接免疫熒光試驗具有較高的特異性，而敏感性則取決于多種不同的因素，包括用于捕獲抗體的細胞類型、實驗室條件和抗豬藍耳病病毒的抗原性。通常情況下，樣本進行ELISA檢測之后再進行間接免疫熒光試驗以排除假陽性的結果。此外，這種方法也可采用唾液和肌肉滲出液樣本來進行試驗。

4.臨床試紙條檢測。試紙條檢測技術除了可用于檢測病毒抗原以外，現在這種方法也可用于檢測豬藍耳病病毒抗體（采用病毒融合蛋白）。膠體金試紙條技術不僅低成本、快捷和方便使用，而且不需要昂貴的設備和專業技術人員。據報告，這種方法的敏感性和特異性分別可達到93%和98%。不過，這種方法還沒有被廣泛使用。

七、病毒分離株的特性

病毒分離株的特性對于管理者及時做出正確的決策來說往往是非常重要的，如決定是否需要把養殖場內的動物轉移到另一個區域、跟蹤病毒的蔓延趨勢以及確定是否新的病毒株存在于豬群內。分子生物學技術，包括RFLP和DNA序列分析要比傳統方法更準確的分析豬藍耳病病毒的特異性。

八、序列分析

目前，病毒基因組的序列分析是鑒定豬藍耳病病毒最常選擇的方法。從血清和受感染組織的樣本中提取的PCR產物進行基因測序和系統進化樹分析，這可為病毒株的分析提供最可靠的數據。ORF5序列的高變區用于區分病毒株是最為可靠的，而且ORF5的全基因序列也常用于分析比對不同的病毒。不同病毒株之間的遺傳進化關系可通過繪制系統進化樹來表示。這可有效反應養殖場群體的感染水平，以監測當地群體內病毒株的變異情況。當在群體內發現潛在的新變異病毒時必須引起高度重視。

九、豬藍耳病病毒（PRRSv）診斷的未來

要想成功的從豬群中控制和清除豬藍耳病病毒的感染，我們需要采用常規監測和疾病診斷相結合的方法。雖然一系列的診斷技術已有效地成為診斷豬藍耳病病毒的手段，但是對于所有的情況和動物，目前仍沒有一種檢測技術是100%可靠的。隨著新技術的不斷引入，人們日益要求確保在合適的時間點對合適的動物進行合適的檢測，并采用合理的干預來優化有效的管理措施，從而最大化的預防或控制疾病的暴發。（By Olivier Duran）